A cross-species approach for the identification of

Drosophila

male sterility genes

Kimihide Ibaraki,

1,†

Mihoko Nakatsuka,

1,†

Takashi Ohsako,

2,†

Masahide Watanabe,

3,†

Yu Miyazaki,

1

Machi Shirakami,

1

Timothy L. Karr,

4

Rikako Sanuki,

3,5

Masatoshi Tomaru,

3,5

and Toshiyuki Takano-Shimizu-Kouno

3,5,

*

1

Applied Biology, Graduate School of Science and Technology, Kyoto Institute of Technology, Kyoto 606-8585, Japan

2

Advanced Technology Center, Kyoto Institute of Technology, Kyoto 606-8585, Japan

3

Department of Drosophila Genomics and Genetic Resources, Advanced Insect Research Promotion Center, Kyoto Institute of Technology, Kyoto 616-8354, Japan

4

Mass Spectroscopy Core Facility, Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, AZ 85257-7205, USA

5

Faculty of Applied Biology, Kyoto Institute of Technology, Kyoto 606-8585, Japan

†

These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author: Email: fruitfly@kit.ac.jp

Abstract

Male reproduction encompasses many essential cellular processes and interactions. As a focal point for these events, sperm offer opportu-
nities for advancing our understanding of sexual reproduction at multiple levels during development. Using male sterility genes identified
in human, mouse, and fruit fly databases as a starting point, 103

Drosophila melanogaster

genes were screened for their association with

male sterility by tissue-specific RNAi knockdown and CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis. This list included 56 genes associated with
male infertility in the human databases, but not found in the

Drosophila

database, resulting in the discovery of 63 new genes associated

with male fertility in

Drosophila

. The phenotypes identified were categorized into six distinct classes affecting sperm development.

Interestingly, the second largest class (Class VI) caused sterility despite apparently normal testis and sperm morphology suggesting that
these proteins may have functions in the mature sperm following spermatogenesis. We focused on one such gene,

Rack 1

, and found that

it plays an important role in two developmental periods, in early germline cells or germline stem cells and in spermatogenic cells or sperm.
Taken together, many genes are yet to be identified and their role in male reproduction, especially after ejaculation, remains to be eluci-
dated in

Drosophila

, where a wealth of data from human and other model organisms would be useful.

Keywords:

human male infertility; male sterility;

Rack1

; cross-species approach;

Drosophila

Introduction

Like many animals, male reproduction of

Drosophila

encompasses

many different cellular processes such as stem-cell division and
maintenance, spermatogonial mitotic divisions, mitosis-to-meio-
sis transition, mitochondrial transformation, compaction of
sperm chromatin, spermatid elongation, maturation, and storage
(

Fuller 1993

). Moreover, ejaculated sperm and seminal fluid pro-

teins combine and mix during copulation, travel to the female re-
productive tract, and are stored in the specialized storage organs,
a seminal receptacle, and paired spermathecae. Sperm storage
and utilization are highly efficient processes with approximately
500 sperm in storage (

Manier

et al.

2010

); the majority (

300) were

used within a week under normal laboratory conditions
(

Manning 1967

;

Herndon and Wolfner 1995

;

Kubli 1996

,

2003

).

Sperm competition is also well documented in

Drosophila

and

many other species (

Harshman and Clark 1998

;

Price

et al.

1999

;

Chen

et al.

2019

) in cases where sperm from different males are

present (

Milkman and Zeitler 1974

;

Griffiths

et al.

1982

;

Harshman and Clark 1998

). Thus, male reproduction encom-

passes interactions at many different levels including (i) protein,

e.g.

, sperm-by-seminal fluid proteins (

Wolfner 1997

) and

paternal-by-maternal molecular interactions (

Loppin

et al.

2005

);

and (ii) cellular,

e.g.

, sperm-by-egg (

Karr 1991

;

Karr and Pitnick

1996

;

Snook and Karr 1998

;

Perotti

et al.

2001

), stem cell-by-sper-

matogonia (

Brawley and Matunis 2004

), niche-by-stem cell

(

Fuchs

et al.

2004

;

Moore and Lemischka 2006

;

Morrison and

Spradling 2008

), and germ cell-by-somatic cyst cell (

Leatherman

and DiNardo 2010

); (iii) tissue and organ levels,

e.g.

, sperm-by-fe-

male reproductive tract (

Miller and Pitnick 2002

), and sperm-by-

sperm (sperm competition) interactions. As a focal point for these
events, a molecular genetic study of sperm offers unique oppor-
tunities for advancing our understanding of sexual reproduction
at multiple levels during development.

Despite such an important model system, male reproduction

seems to be less studied and less well characterized. An indica-
tion of this comes from a database study of human and model
organisms. The human disease databases, the Online Mendelian
Inheritance in Man (OMIM, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

)

and GeneCards (https://www.genecards.org), together with list
more than 1000 genes that are associated with male infertility.
However, many of their orthologs are not found in male infertility
or sterility gene lists extracted from the mouse and fly databases

Received:

April 07, 2021.

Accepted:

May 13, 2021

V

C

The Author(s) 2021. Published by Oxford University Press on behalf of Genetics Society of America.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which
permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2

G3

, 2021,

11(8),

jkab183

DOI: 10.1093/g3journal/jkab183

Advance Access Publication Date: 29 May 2021

Mutant Screen Report

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

(Mouse Genome Informatics, MGI, http://www.informatics.jax.
org; International Mouse Phenotyping Consortium, IMPC, https://
www.mousephenotype.org; and FlyBase, https://flybase.org). The
low level of overlap among the three male infertility and sterility
gene lists suggests that these gene lists are far from complete
and that many genes remain to be identified in all three species.
We therefore examined and compared the human male infertil-
ity gene list with

Drosophila

without regard to whether or not the

Drosophila

genes were annotated with male sterility. The resulting

list included 103 fly genes, including 56 genes associated with
male infertility in the human databases but not annotated as
such in FlyBase. The function of these genes in sperm develop-
ment was then screened using tissue-specific RNAi knockdown (a
total of 155 RNAi stocks), finding 63 new genes that are likely as-
sociated with male sterility in

Drosophila

. This finding not only

supports the hypothesis that many genes remain to be identified
in both human and fly, but also highlighted the potential advan-
tage of cross-species study, particularly using human data.

Of the 63 new genes identified in our screen,

Rack1

, a gene in-

volved in protein kinase C signal transduction, was chosen for ad-
ditional study. As a Class VI phenotype gene, RNAi knockdown of

Rack1

resulted in complete sterility without obvious morphologi-

cal changes in the testis and sperm. This class of mutants are
particular intriguing because such genes have rarely been
reported despite the expectation that the many modifications of
sperm occur during maturation and travel into, and through, the
female reproductive tract (

Castrillon

et al.

1993

;

Ohsako and

Yamamoto 2011

;

Skerget

et al.

2015

). We confirmed the associa-

tion with male sterility by CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis
and then found that

Rack1

plays an important role in two devel-

opmental periods, in early germline cells or germline stem cells
and in spermatogenic cells or sperm. Finally, we also show that
the human

RACK1

gene can substitute at least for the latter func-

tion of the fly

Rack1

, further supporting the similarity of the

mechanisms of reproduction in the two species.

Materials and methods

Drosophila

strains

To drive expression of UAS constructs in testes, we used two
germline and two soma

GAL4

drivers:

nos-GAL4

(KYOTO Stock

Center, DGRC 107955),

bam-GAL4

(provided by Dennis M.

McKearin),

ptc-GAL4

(DGRC 106629), and

upd-GAL4

(provided by

Ting Xie). RNAi strains used in this study are listed in Reagents
table. We also used two

UAS-Cas9.P

strains to apply the CRISPR/

Cas9 system (Bloomington Drosophila Stock Center, BDSC 54594
and BDSC 54592), and

ProtB-GFP

strain (DGRC 109643) to visualize

sperm. We also used Oregon R (DGRC 105669) and a highly inbred

y w

(TT16,

Tanaka

et al.

2014

) stocks as controls.

Construction of UAS-ORF and UAS-sgRNA clones
and strains

Fly

Rack1

and human

RACK1

open reading frames (ORFs) were

amplified by PCR using the RE74715 cDNA gold clone obtained
from Drosophila Genomics Resource Center and the 3455986
MGC clone from DNAFORM, respectively. They were first
cloned into the pCR8/GW/TOPO or pENTR/D-TOPO (Invitrogen)
and then into pUASg_attB vector (

Bischof

et al.

2013

). The

plasmid DNA was injected into embryos of

y M

f

vas-int.Dm

g

ZH-

2A w; PBac

f

y[

þ

]-attP-3B

g

VK00033

(DGRC 130448) and

y v

P

f

nos-phiC31\int.NLS

g

X; P

f

y[

þ

t7.7]-CaryP

g

attP40

(BDSC 25709).

To generate a single-guide RNAs (sgRNAs) construct, we first

determined

Rack1

sequences of strains used for CRISPR/Cas9

mutagenesis and then designed sequences of sgRNAs that tar-
geted exon-intron boundaries, one in that of first exon/first in-
tron and the other in that of first intron/second exon, by using
CRISPR direct (http://crispr.dbcls.jp

;

Naito

et al.

2015

). These two

targeted sequences were then cloned into a single pCFD6 vector
by PCR with Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB) and NEBuilder
HiFi DNA Assembly (NEB), resulting in a construct of

UAS-

(DmtRNAGly)-(gRNA-Rack1[1])-(OstRNAGly)-(gRNA-Rack1[2])-(OstRN
AGly)-terminator

(

Port and Bullock 2016

). The construct was then

injected into embryos of

y M

f

vas-int.Dm

g

ZH-2A w; PBac

f

attP-

3B

g

VK00033

. Primers (gR_CG7111_F1 and gR_CG7111_R1) used for

the PCR amplification are given in Reagents table and the
CRISPR/Cas9 target sequences are TGGCGATTACTTACCACGGG
and CAGACAAGACCCTGATCGTG.

RNAi screening

We crossed two (2- or 3-day-old) females of the

GAL4

driver

strains to two males of

UAS-RNAi

strains at 25

for a few days

and then incubated the vials at 27

until adult offspring emerged.

F1 virgin males (RNAi males) were collected and aged at 25

, and

all subsequent crosses were also done at 25

. At the same time,

five pairs of

y w

strain were placed in a vial, and discarded 2 days

later. The F1 virgin females were collected at 25

. For fertility as-

sessment, a single 2- or 3-day-old RNAi male was crossed to a sin-
gle

y w

female. They were transferred to a new vial 4 or 5 days

later, and discarded on the ninth day after cross. As controls, we
counted the number of offspring of single

y w

females crossed

with single males of the following six strains: Oregon R [the num-
ber of replications (

n

)

¼

8, mean

6

standard deviation

¼

92.0

6

10.4,

minimum—maximum

¼

78–112],

y

w

(

n

¼

8,

65.0

6

9.1, 53–79),

nos-GAL4

(

n

¼

8, 98

6

6.7, 89–107),

bam-GAL4

(

n

¼

5, 84.2

6

6.8, 75–91),

upd-GAL4

(

n

¼

8, 88.0

6

8.6, 74–99), and

ptc-GAL4

(

n

¼

8, 98.0

6

6.7, 87–109). From these data, we chose a

cut-off point of less than 30 offspring for semi-sterile males,
which was distinguished from sterile ones that produced no off-
spring. We dissected 2- or 3-day-old virgin males and assessed vi-
sually testis morphology by light microscopy, the presence of
sperm in the seminal vesicles, and sperm motility. We then clas-
sified 110 sterile or semi-sterile males into six classes following
the convention of previous studies (

Castrillon

et al.

1993

;

Wakimoto

et al.

2004

): Class I, proliferation- or growth-phase de-

fect (reduced cell number or thin testis); Class II, meiotic entry or
meiotic division defect (no onion-stage spermatid or no early
elongated spermatid); Class III, elongation, coiling, or individuali-
zation defect (no accumulation of coiling spermatids); Class IV,
spermatid-release defect (accumulation of coiling spermatids in
the distal end of testis); Class V, no or very few mature sperm in
the seminal vesicle despite apparently normal spermatogenesis;
Class VI, apparently normal testis. In addition, E refers to no
sperm in seminal vesicles in

Supplementary Table S5

.

Fertility test

Fertility of

Rack1

RNAi knockdown males was measured by the

number of offspring and hatchability of eggs produced by single
females mated with single males in question. Females of the

GAL4

driver strains were crossed to males of

UAS-RNAi[Rack1]

strains (

RNAi-KK109073

, VDRC 104470, and

RNAi-TRiP.GL00637

,

BDSC 38198) and transferred to new vials every 3 days. But, un-
like the RNAi screening experiments, all tested males were raised
at 25

during the entire period of experiments. Three- to five-day-

old virgin F1 males were individually crossed to

y w

single

females. Females copulated 15 minutes or more were isolated
and then allowed to lay eggs in single vials for 3 days to count the

2 |

G3,

2021, Vol. 11, No. 8

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

number of offspring. The parental females were placed to egg
counting chamber with a 20-well grape-juice-agar plate for 1 day
and transferred to new plates twice (in total, three plates for each
female) to assess egg hatchability. One and two days after trans-
fer, we counted the number of hatched and unhatched eggs. For
rescue experiments,

bam

-

GAL4

females were crossed to males of

RNAi-KK109073; UAS-dRack1

or

RNAi-KK109073; UAS-hRACK1

strains.

For CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, females carrying

GAL4

and

UAS-Cas9.P

were crossed to males of the

UAS-sgRNAs

strain and we assessed male fertility in the same way.

Sperm count in female reproductive organs

We crossed

bam-GAL4

;

ProtB-GFP

females to

RNAi-KK109073

males and then obtained F1 males as in the RNAi knockdown
experiments. Virgin F1 males as well as

bam-GAL4

;

ProtB-GFP

males as a control were aged for 3 to 5 days and then individually
crossed to

y w

females. Females copulated 15 minutes or more

were dissected and fixed at 1 hour after the end of copulation. We
counted the number of sperm in the reproductive organs by eyes.

Data availability

All database search results are presented in

Supplementary

Tables S2 –S4

and the RNAi screening results in

Supplementary

Table S5

. All strains used in this study are included in the

Reagent Table and the newly generated

UAS-dRack1

and

UAS-

hRACK1

strains are available from KYOTO Stock Center.

Supplementary material

is available at

G3

online.

Results

RNAi screening

In total, 1390 human genes associated with male infertility were
identified in the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM,
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

, as of March 18, 2020) and

GeneCards (https://www.genecards.org, as of March 14, 2020) data-
bases (

Table 1

and

Supplementary Table S2

). However, many of

their orthologs were not found in male infertility or sterility gene
lists (

Supplementary Tables S3 and S4

) extracted from the mouse

and fly databases (Mouse Genome Informatics, MGI, http://www.in
formatics.jax.org

; International Mouse Phenotyping Consortium,

IMPC, https://www.mousephenotype.org; and FlyBase, https://fly
base.org). Indeed, orthologous relationships exist only between 278
(20.0%) out of the 1390 human genes and 272 (26.9%) of 1013 mouse
genes and between 120 (8.6%) of the human genes and 88 (21.5%) of
410 fly genes. The fraction of common genes were even lower

between the two model organisms, 8.3% of the mouse genes and
17.8% of the fly genes. The low similarities among the three male
infertility and sterility gene lists are partly due to different method-
ologies adopted by the respective scientific communities for gene
discovery; in particular, the history and phenotypic description of
human male infertility quite differ from those of the model organ-
isms. The main causes of human male infertility include varicocele,
hypogonadism, urogenital infection, immune system factors, sex-
ual factors, and systemic disease (

Poongothai

et al.

2009

;

Jungwirth

et al.

2012

). They are not necessarily directly related to sperm viabil-

ity and functions; variants affecting such processes are potentially
included in the human infertility gene list. It is very likely that these
gene lists are far from complete and that many genes remain to be
identified in all three species. Given this notion of the incomplete-
ness of these lists, the human male infertility gene list could be
used to identify new male sterility genes of

Drosophila

.

Here, we tested this possibility by RNAi screening of 103 fly

genes (

Supplementary Table S1

) including 56 ones associated

with male infertility in the human databases but not in the
FlyBase. We performed tissue-specific knockdown of those fly
genes (155 RNAi stocks) by using two germline and two somatic

GAL4

drivers:

nos-GAL4

for germline cells from embryonic stage

9 onward, germline stem cells (GSC), and spermatogonia,

bam-

GAL4

for late spermatogonia and early spermatocytes,

ptc-

GAL4

for cyst stem cells and cyst cells, and

upd-GAL4

for hub

cells. The results are given in

Supplementary Table S5

, in

which 61 genes were found to cause male sterility or semi-ste-
rility when combined with

bam-GAL4

, 10 genes with

nos-GAL4

,

26 genes with

ptc-GAL4

, and 22 with

upd-GAL4

. In sum, RNAi

knockdown males of 31 and 44 genes caused male sterility and
semi-sterility, respectively (see Materials and Methods for their
definitions). Out of 13 genes associated with male sterility in
FlyBase (

Supplementary Table S1

), 12 were confirmed in this

screen (10 male sterile and 2 semi-sterile genes); the only ex-
ception is

Ecdysone receptor

(

EcR

, CG1765). A single PZ insertion

in an intron of

EcR

is reported to cause male sterility, but, to

our best knowledge, this has not been verified yet (

Spradling

et al.

1999

). Therefore, our screening approach identified known

genes associated with male sterility while uncovering addi-
tional genes previously not known to be associated with this
phenotype. By using the orthologs of the human genes associ-
ated with male infertility, we found 63 new genes that were
likely involved in male fertility in

Drosophila

. This finding sup-

ports our notion that many genes remain to be identified in
both human and fly.

Table 1

Male infertility protein-coding genes in human, mouse, and fly databases

Species

Source

Search date

Search term

Number of genes

Human

GeneCards

March 14, 2020

“male infertility”

1,365

—

OMIM

a

March 18, 2020

“male infertility”

120

—

Sum

—

—

1,390

—

—

—

1,378 (99.1%) have known mouse orthologs

—

—

—

1,102 (79.3%) have known fly orthologs

Mouse

MGI

b

March 14, 2020

“male infertility”

710

—

IMPC

c

March 14, 2020

“male infertility”

489

—

Sum

—

—

1,013

—

—

—

899 (88.7%) have known fly orthologs

Fly

FlyBase

March 14, 2020

“male sterility”

410

We searched the databases for “male infertility” human and mouse genes and “male sterility” fly genes and extracted only protein-coding genes (

Supplementary

Tables S2

–

S4

).

a

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man.

b

MGI: Mouse Genome Informatics.

c

IMPC: International Mouse Phenotyping Consortium.

K. Ibaraki

et al.

| 3

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

While the phenotypes associated with reduced male fertility

largely varied among both genes and drivers (

Supplementary

Table S5

), the largest were Class I (proliferation- or growth-phase

defect with 31 appearances) and Class VI (apparently normal tes-
tis with 28 appearances). The

bam-GAL4

driver phenotypes

ranged evenly across all six classes, while

upd

- and

ptc

-GAL4

driver combinations tended to concentrate on Classes I and VI.
Class VI includes six genes for which RNAi knockdown caused
complete male sterility (three with

bam-GAL4

, one with

nos-GAL4

,

and two with

ptc-GAL4

,

Supplementary Table S5

).

Rack1

is required for male fertility in two

developmental periods

Receptor of activated protein kinase C 1

(

Rack1

) is a

Drosophila

ortho-

log of human

RACK1

gene, which encodes a scaffolding protein

involved in recruitment, assembly, and regulation of a variety of
signaling molecules (GeneCards, www.genecards.org

,

Stelzer

et al

. 2016

). RACK1 protein is identified as one of epididymal

sperm-located proteins (

Li

et al.

2010

). In addition,

RACK1

is

suggested to be associated with Noonan Syndrome 1, which
could cause male infertility (MalaCards, www.malacards.org

,

Rappaport

et al.

2017

). Mutants of the essential

Drosophila Rack1

gene are known to cause female sterility (

Kadrmas

et al.

2007

),

but its association with male sterility has not yet been known.
Indeed, the expression level of

Rack1

is very low in adult males

than in embryos, larvae, and adult females (

Kadrmas

et al.

2007

).

The present RNAi phenotypes with the

bam-GAL4

driver are the

first indication of an involvement of the

Rack1

with male fertility.

Here, we added tissue-specific CRISPR/Cas9-mediated mutagene-
sis to the RNAi knockdown experiments and characterized the
roles of the

Rack1

in male fertility in more detail.

On the basis of the present RNAi screening results with the

bam-GAL4

driver,

Rack1

is one of the three genes that exhibited

the Class-VI sterile phenotype: male sterility without obvious
changes in the testis and sperm morphology (

Figure 1, B, D, and

E

). The Class VI mutants are particularly intriguing because

such genes remain rare despite the expectation that many
changes occur in sperm during maturation and traveling in fe-
male reproductive tract (

Castrillon

et al.

1993

;

Ohsako and

Yamamoto 2011

;

Skerget

et al.

2015

). To further characterize

the roles of the

Rack1

in male fertility, we first confirmed the

reduced fertility of

Rack1

RNAi knockdown males by crossing

additional RNAi line (TRiP.GL00637) with the

bam-GAL4

driver

(

Figure 1, D and E

). Eggs laid by females mated with these RNAi

knockdown males had significantly reduced hatchability. In
addition to the

Rack1

RNAi construct, concomitant expression

of

Drosophila Rack1

(

dRack1

) open reading frame (ORF) restored

egg hatchability, implying that

Rack1

is indeed required for nor-

mal male fertility (

Figure 1, D and E

).

To further understand the cause of the reduced fertility of

Rack1

RNAi knockdown males, we examined sperm storage in

seminal receptacle and a pair of spermathecae at 1 hour after
copulation by using a

ProtB-GFP

marker that produces highly fluo-

rescent sperm nuclei (

Manier

et al.

2010

). While there was no dif-

ference in the total number of sperm in the uterus and sperm
storage organs between the two types of males, the number of
sperm in the female’s sperm storage organs was significantly re-
duced for the

Rack1

RNAi knockdown males as compared to the

control males (

Table 2

and

Supplementary Figure S1

). These

results suggested that the sperm were immature or not fully acti-
vated. Indeed, while sperm of the control males were localized at
the anterior uterus where the sperm storage organs are located,

sperm of the

Rack1

RNAi males remained scattered throughout

the uterus (

Supplementary Figure S2

).

Tissue-specific CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis with the

bam-GAL4

driver and two gRNAs targeting

Rack1

also significantly

reduced hatchability (

Figure 1

). This again suggested that normal

transcription of

Rack1

gene in late spermatogonia or early sper-

matocytes is required for male fertility.

Consistent with the first RNAi screening result, we detected

neither a significant reduction in egg hatchability and the num-
ber of offspring nor morphological changes in testes and sperm
when using the second RNAi and

nos-GAL4

driver lines (

Figure 2,

A, D, and E

). However, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis

caused marked underdevelopment of testes and spermatogenesis
was severely disrupted, although the testes still seem to contain
some cells at various stages of differentiation including sperma-
tocytes and spermatids (

Figure 2B

). In any case,

Rack1

mutagen-

ized males were completely sterile (

Figure 2, D, and E

). The

sterility was partially rescued by expression of

Rack1

(

Figure 2,

C–E

), in which two sgRNA were designed to target exon-intron

boundaries and then exogenous

Rack1

ORF was expected not to

be affected by the CRISPR/Cas9 mutagenesis. Taken together, we
suggest that

Rack1

also plays an essential role in germline cells

from embryonic stage 9 onward or germline stem cells.

Human

RACK1

can replace

Drosophila Rack1

during spermatogenesis

Like

Drosophila Rack1

, overexpression of human

RACK1

ORF signif-

icantly increased the hatchability of eggs laid by females mated
with the RNAi-treated males (

Figure 1, D and E

) and there was no

difference in the effect between the

Drosophila

and human ORFs.

Discussion

Mainly on the basis of human database information combined
with mouse and

Drosophila

, we identified 63 new genes that were

likely associated with male fertility in

Drosophila

, suggesting the

similarity at the molecular level of male reproduction between
human and fly. We propose that the results obtained here are
representative of, and applicable to other, human male infertility
genes and that many genes remain to be identified in both spe-
cies. An obvious question immediately arises: how many genes
are involved in male reproduction in general? Powerful proteomic
analyses of

Drosophila

sperm and testes identified more than 1000

protein genes (

Dorus

et al.

2006

;

Takemori and Yamamoto 2009

;

Wasbrough

et al.

2010

) and proteomes of seminal fluid proteins

independently identified more than 100 protein genes (

Walker

et al.

2006

;

Findlay

et al.

2008

; see also

Ravi Ram and Wolfner

2007

). In human, more than 2000 proteins are listed as male pro-

teins such as testis, spermatozoon, and seminal vesicle proteins
(

Wilhelm

et al.

2014

;

Uhle´n

et al.

2015

); in mouse, 1766 proteins

are identified from sperm collected from the epididymis (

Skerget

et al.

2015

). More recently,

Ga¨rtner

et al.

(2019)

studied testes pro-

teomes of

Drosophila

larvae, pupae, and adults separately and

identified, in total, 6171 proteins. On the other hand, transcrip-
tional analyses unveil the highly complex testis transcriptome,
with more than 10,000 genes expressed in both

Drosophila

(

Parisi

et al.

2004

;

Vibranovski

et al.

2009

;

Graveley

et al.

2011

;

Vedelek

et al.

2018

) and mammals (

Ramsko¨ld

et al.

2009

;

Soumillon

et al.

2013

). In sum, it is conceivable that, although the exact number

is not known, much more protein genes remain to be identified.

If many genes are involved in male sterility, why did they fail

to be identified? Like other developmental processes, genetic
screens in

Drosophila

(

Hackstein 1991

;

Castrillon

et al.

1993

;

4 |

G3,

2021, Vol. 11, No. 8

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

Wakimoto

et al.

2004

) have been productive. Especially,

Wakimoto

et al.

(2004)

identified 2131 male sterile lines from a

collection

of

lines

carrying

chemically

mutagenized

chromosomes; to our best knowledge, many of them have not
been molecularly characterized so far. Recently, in the same line
of our study,

Yu

et al.

(2015)

have studied 22

Drosophila

genes

Figure 1

Reduced fertility of

bam-GAL4

-driven

Rack1

RNAi-knockdown and CRISPR/Cas9-mutagenized males without obvious morphological changes

and its rescue by concomitant expression of

Drosophila Rack1

or human

RACK1

ORF. Testes of

bam-GAL4

/Y;

CyO

/

þ

(control) (A),

bam-GAL4

/Y;

RNAi-

KK109073

/

þ

(B), and

bam-GAL4

/Y

; UAS-Cas9.P

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(C) males. Hatchability of eggs (D) and the number of offspring (E) produced by single

females mated with treated males with standard error of the mean. The genotypes of males were

bam-GAL4

/Y;

CyO

/

þ

(control,

bam

>

þ

),

bam-GAL4

/Y;

RNAi-[Rack1]

/

þ

(

bam

>

RNAi-KK109073

and

bam

>

RNAi-TRiP.GL00637

),

bam-GAL4

/Y;

RNAi-KK109073

/

þ

;

UAS-dRack1

(or

UAS-hRACK1)

/

þ

(

bam

>

RNAi-

KK109073

þ

dRack1

and

bam

>

RNAi-KK109073

þ

hRACK1

), and

bam-GAL4

/Y

; UAS-Cas9.P

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(

bam

>

CRISPR-Rack1

). Egg hatchability of

bam

>

RNAi-KK109073

,

bam

>

RNAi-TRiP.GL00637

, and

bam

>

CRISPR

-

Rack1

males was significantly lower than that of control, and that of

bam

>

RNAi-

KK109073

þ

dRack1

and

bam

>

RNAi-KK109073

þ

hRACK1

was significantly higher than that of

bam

>

RNAi-KK109073

(all

P

<

0.0001, Mann–Whitney

U

-test).

The number of offspring produced by

bam

>

RNAi-KK109073

and

bam

>

RNAi-TRiP.GL00637

was significantly smaller than that of the control (both

P

<

0.0001, Mann–Whitney

U

-test), while that of

bam

>

RNAi-KK109073

þ

dRack1

(

P

<

0.001, Mann–Whitney

U

-test) and

bam

>

RNAi-KK109073

þ

hRACK1

(

P

<

0.01, Mann–Whitney

U

-test) was significantly larger than that of

bam

>

RNAi-KK109073

.

Table 2

The number of sperm stored in female’s sperm storage organs

Male

Uterus

Spermathecae

Seminal receptacle

Sum

bam-GAL4

/Y

;

ProtB-GFP

990.4

6

72.4

(547–1,244)

295.8

6

9.3

(247–329)

637.9

6

24.9

(544–756)

1,924.1

6

87.7

(1,385–2,258)

bam-GAL4

/Y;

RNAi-KK109073

/

þ

;

ProtB-GFP

/

þ

1,419.5

6

105.1

(1,127–1,975)*

158.5

6

36.6

(14–361)**

201.0

6

59.2

(3–538)***

1,779.0

6

80.3

(1,477–2,129)

Virgin males were individually mated with single females and the number of sperm was counted at 1 hour after copulation. For both males, the sample size was
ten. The numbers given are means

6

standard errors of the means with minimum and maximum numbers in parentheses. Mann–Whitney

U

-test was performed

to test differences in sperm number between the two groups (

*P

<

0.05, **

P

<

0.01, and ***

P

<

0.002).

K. Ibaraki

et al.

| 5

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

based on human genome-wide association study data for nonob-
structive azoospermia by RNAi and successfully identified 7
genes essential for male fertility.

Wen

et al.

(2016)

also screened

105 long noncoding RNAs by CRISPR/Cas9 system and found 33
genes required for normal male fertility. A shortage of large-scale
studies exploring male sterile genes at the molecular level is still
a reason for the incompleteness of the male sterility gene list.
Despite an important model system, many genes are yet to be
identified and their roles in male reproduction remain to be eluci-
dated.

To validate the RNAi screening results, we performed a further

analysis of

Rack1

, which is one of the six genes exhibited the

Class-VI sterile phenotype, and obtained evidence that

Rack1

is

indeed essential for male fertility. Downregulation of

Rack1

under

the control of

bam-GAL4

reduced fertility in the two RNAi lines

studied. In contrast, when combined with the

nos-GAL4

driver,

both lines did not produce any phenotype. The two drivers differ

in the timing of expression. The

nos-GAL4

driver induces target

expression in germline cells from embryonic stage 9 onward and
germline stem cells (

Van Doren

et al.

1998

), while the

bam-GAL4

driver does not induce expression in germline stem cells, but
does in late spermatogonia and early spermatocytes (

Chen and

McKearin 2003

). Thus, one explanation for the contrasting results

between the two drivers is that the

Rack1

expression level re-

quired in late spermatogonia and early spermatocytes may be
higher than that in germ cells in the earlier stages. This is not
surprising because the time window for transcription in the for-
mer cells is much shorter than that in germline stem cells
(

Olivieri and Olivieri 1965

; see also

Barreau

et al.

2008

).

Alternatively, although not mutually exclusive, the

Rack1

knock-

down efficiency by the

nos-GAL4

driver may not be sufficiently

high compared to the

bam-GAL4

driver. Given the present results,

the former explanation is more likely. The phenotypes were con-
sistent across the two independent RNAi lines and the reduced

Figure 2

No obvious phenotype in

nos-GAL4

-driven

Rack1

RNAi-knockdown males, but testis underdevelopment and disruption of spermatogenesis of

CRISPR/Cas9-mutagenized males. Testes of

RNAi-TRiP.GL00637

/

þ

;

nos-GAL4

/

þ

(A),

UAS-Cas9.P

/

þ

;

nos-GAL4

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(B), and

UAS-Cas9.P

/

UAS-

dRack1

;

nos-GAL4

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(C) males. Hatchability of eggs (D) and the number offspring (E) produced by single females mated with treated

males with standard error of the mean. The genotypes of males were

CyO

/

þ

;

nos-GAL4

/

þ

(control),

RNAi-KK109073

/

þ

;

nos-GAL4

/

þ

(

RNAi-KK109073

),

RNAi-TRiP.GL00637

/

þ

;

nos-GAL4

/

þ

(

RNAi-TRiP.GL00637

),

UAS-Cas9.P

/

þ

;

nos-GAL4

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(CRISPR-

Rack1

), and

UAS-Cas9.P

/

UAS-dRack1

;

nos-

GAL4

/

UAS-sgRNAs-Rack1

(CRISPR-

Rack1

þ

dRack1

) males. There was no significant difference in hatchability and the number of offspring between the

control and RNAi knockdown males, except for the number of offspring between the control and

RNAi-TRiP.GL00637

males (

P

<

0.0001, Mann–Whitney

U

-test). The CRISPR/Cas9-mediated mutagenized males were completely sterile that was partially rescued by concomitant expression of

Drosophila

Rack1

.

6 |

G3,

2021, Vol. 11, No. 8

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

hatchability of eggs laid by females mated with

bam

>

Rack1

RNAi-

knockdown males was largely rescued by concomitant expres-
sion of the

UAS-Rack1

transgene. What is more, CRISPR/Cas9-me-

diated mutagenesis combined with the

bam-GAL4

driver also

resulted in reduced hatchability. These results indicate a require-
ment of

Rack1

transcription in developing spermatogenic cells.

On the other hand, when we combined the CRISPR/Cas9 system
with the

nos-GAL4

driver, the resultant males were characterized

by marked underdevelopment of testes and disruption of sper-
matogenesis (

Figure 2C

), suggesting a requirement of

Rack1

in the

earlier stages, namely in early germline cells or germline stem
cells or both. Thus, there seem to be two developmental periods,
in which

Rack1

transcription is required for male fertility.

Rack1

and its orthologs are known to be required for migratory

and neuronal cells. The

Drosophila Rack1

gene is essential for mi-

gration and cluster cohesion of border cells, a group of migratory
follicle cells, possibly by regulating cell-cell adhesion between
border cells or between border cells and nurse cells (

Luo

et al.

2015

). The

Caenorhabditis elegans rack-1

gene is required for lamel-

lipodia and filopodia formation, axon pathfinding, and migration
of the gonadal distal tip cells (

Demarco and Lundquist 2010

). In

addition, mouse RACK1 protein is localized to, and required for
the formation of, point contacts in growth cones, which are adhe-
sion sites linking the actin network within growth cones to the
extracellular matrix and local translation sites (

Kershner and

Welshhans 2017

).

Rack1

may also play a role in cell-cell adhesion

or contact-dependent signaling during spermatogenesis and
sperm maturation; however, at present, the exact biological func-
tions of RACK1 protein remain to be explored and are the subject
of future investigation.

In this study, Class VI phenotype observed in

bam

>

Rack1

RNAi constitutes the second largest class in the present screen,
although such mutants remain rare (

Castrillon

et al.

1993

;

Ohsako and Yamamoto 2011

). This may reflect the general na-

ture of hypomorphic mutations and we could see earlier phe-
notypes by gene disruption. Alternatively, these gene products
may be required specifically for sperm maturation or post-
ejaculation function. While we cannot rule out the former, the
latter may be applied to several genes including

Rack1

. Indeed,

early stages of spermatogenesis such as stem-cell mainte-
nance and meiotic division have been extensively studied, but
not the late stages so far; therefore, much more genes could be
involved in sperm maturation and post-ejaculation function.

In this study, we showed that the human data resulted mostly

from genome-wide association study (GWAS) and omics study
are effectively evaluated in fruit fly. The availability of many
types of comprehensive and integrated databases (

Brody 2019

)

makes such cross-species studies easier to perform. Together
with them, we will soon have a more comprehensive understand-
ing of male reproduction and therefore of male-female interac-
tions before and after fertilization.

Acknowledgments

The authors thank Asayo Yamamoto and Yasushi Kanamori for
their assistance with the database search. They also thank
National BioResource Project (KYOTO Stock Center and NIG FLY),
Bloomington Drosophila Stock Center, and Vienna Drosophila
Resource Center for fly stocks and Drosophila Genomics
Resource Center and DNAFORM for clones.

Funding

This work was supported by grants JSPS KAKENHI Grant Number
JP16K07463 and JP19K06780 to TTSK and MT.

Conflicts of interest

None declared.

Literature cited

Barreau C, Benson E, Gudmannsdottir E, Newton F, White-Cooper H.

2008.

Post-meiotic

transcription

in

Drosophila

testes.

Development. 135:1897–1902.

Bischof J, Bjo¨rklund M, Furger E, Schertel C, Taipale J,

et al.

2013. A

versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome
library in Drosophila. Development. 140:2434–2442.

Brawley C, Matunis E. 2004. Regeneration of male germline stem

cells by spermatogonial dedifferentiation

in vivo

. Science. 304:

1331–1334.

Brody T. 2019. Databases and web sites for neurogenetics. Curr

Protoc Neurosci. 89:e82.

Castrillon DH, Gonczy P, Alexander S, Rawson R, Eberhart CG,

et al.

1993. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in

Drosophila melanogaster

: characterization of male-sterile mutants

generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135:
489–505.

Chen DS, Delbare SYN, White SL, Sitnik J, Chatterjee M,

et al.

2019.

Female genetic contributions to sperm competition in

Drosophila

melanogaster

. Genetics. 212:789–800.

Chen D, McKearin DM. 2003. A discrete transcriptional silencer in

the

bam

gene determines asymmetric division of the

Drosophila

germline stem cell. Development. 130:1159–1170.

Demarco RS, Lundquist EA. 2010. RACK-1 acts with Rac GTPase sig-

naling and UNC-115/abLIM in

Caenorhabditis elegans

axon path-

finding and cell migration. PLoS Genet. 6:e1001215.

Dorus S, Busby SA, Gerike U, Shabanowitz J, Hunt DF,

et al.

2006.

Genomic and functional evolution of the

Drosophila melanogaster

sperm proteome. Nat Genet. 38:1440–1445.

Findlay GD, Yi X, MacCoss MJ, Swanson WJ. 2008. Proteomics reveals

novel

Drosophila

seminal fluid proteins transferred at mating.

PLoS Biol. 6:e178.

Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. 2004. Socializing with the neighbors:

stem cells and their niche. Cell. 116:769–778.

Fuller MT. 1993. Spermatogenesis. In: M, Bate AM Arias, editors.

Development of Drosophila. New York, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press. p. 71–147.

Ga¨rtner SMK, Hundertmark T, Nolte H, Theofel I, Eren-Ghiani Z,

et al.

2019. Stage-specific testes proteomics of

Drosophila melanogaster

identifies essential proteins for male fertility. Eur J Cell Biol. 98:
103–115.

Graveley BR, Brooks AN, Carlson JW, Duff MO, Landolin JM,

et al.

2011. The developmental transcriptome of

Drosophila mela-

nogaster

. Nature. 471:473–479.

Griffiths RC, McKechnie SW, McKenzie JA. 1982. Multiple mating and

sperm displacement in a natural population of

Drosophila mela-

nogaster

. Theor Appl Genet. 62:89–96.

Hackstein JH. 1991. Spermatogenesis in Drosophila. a genetic ap-

proach to cellular and subcellular differentiation. Eur J Cell Biol.
56:151–169.

Harshman LG, Clark AG. 1998. Inference of sperm competition from

broods of field-caught Drosophila. Evolution. 52:1334–1341.

K. Ibaraki

et al.

| 7

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

Herndon LA, Wolfner MF. 1995. A Drosophila seminal fluid protein,

Acp26Aa, stimulates egg laying in females for 1 day after mating.
Proc Natl Acad Sci USA. 92:10114–10118.

Jungwirth A, Giwercman A, Tournaye H, Diemer T, Kopa Z,

et al.

2012. European Association of Urology guidelines on Male
Infertility: the 2012 update. Eur Urol. 62:324–332.

Kadrmas JL, Smith MA, Pronovost SM, Beckerle MC. 2007.

Characterization of RACK1 function in

Drosophila

development.

Dev Dynam. 236:2207–2215.

Karr TL. 1991. Intracellular sperm/egg interactions in Drosophila: a

three-dimensional structural analysis of a paternal product in
the developing egg. Mechanisms Dev. 34:101–111.

Karr TL, Pitnick S. 1996. The ins and outs of fertilization. Nature. 379:

405–406.

Kershner L, Welshhans K. 2017. RACK1 is necessary for the forma-

tion of point contacts and regulates axon growth. Dev Neurobiol.
77:1038–1056.

Kubli E. 1996. The Drosophila sex-peptide: a peptide pheromone in-

volved in reproduction. Adv Dev Biochem. 4:99–128.

Kubli E. 2003. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.

Cell Mol Life Sci. 60:1689–1704.

Leatherman JL, DiNardo S. 2010. Germline self-renewal requires cyst

stem cells and

stat

regulates niche adhesion in

Drosophila

testes.

Nat Cell Biol. 12:806–811.

Li JY, Liu FJ, Wang HY, Liu X, Liu J,

et al.

2010. Systematic mapping

and functional analysis of a family of human epididymal secre-
tory sperm-located proteins. Mol Cell Proteomics. 11:2517–2528.

Loppin B, Lepetit D, Dorus S, Couble P, Karr TL. 2005. Origin and neo-

functionalization of a Drosophila paternal effect gene essential
for zygote viability. Curr Biol. 15:87–93.

Luo J, Zuo JT, Wu J, Wan P, Kang D,

et al.

2015.

In vivo

RNAi screen

identifies candidate signaling genes required for collective cell
migration in

Drosophila

ovary. Sci China Life Sci. 58:379–389.

Manning A. 1967. The control of sexual receptivity in female

Drosophila. Anim Behav. 15:239–250.

Manier MK, Belote JM, Berben KS, Novikov D, Stuart WT,

et al.

2010.

Resolving mechanisms of competitive fertilization success in

Drosophila melanogaster

. Science. 328:354–357.

Milkman R, Zeitler RR. 1974. Concurrent multiple paternity in natu-

ral and laboratory populations of

Drosophila melanogaster

.

Genetics. 78:1191–1193.

Miller GT, Pitnick S. 2002. Sperm-female coevolution in Drosophila.

Science. 298:1230–1233.

Moore KA, Lemischka IR. 2006. Stem cells and their niches. Science.

311:1880–1885.

Morrison SJ, Spradling AC. 2008. Stem cells and niches: mechanisms

that promote stem cell maintenance throughout life. Cell. 132:
598–611.

Naito Y, Hino K, Bono H, Ui-Tei K. 2015. CRISPRdirect: software for

designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.
Bioinformatics. 31:1120–1123.

Ohsako T, Yamamoto M-T. 2011. Sperm of the

wasted

mutant are

wasted when females utilize the stored sperm in

Drosophila mela-

nogaster

. Genes Genet Syst. 86:97–108.

Olivieri G, Olivieri A. 1965. Autoradiographic study of nucleic acid

synthesis during spermatogenesis in

Drosophila melanogaster

.

Mutat Res. 2:366–380.

Parisi M, Nuttall R, Edwards P, Minor J, Naiman D,

et al.

2004. A sur-

vey of ovary-, testis-, and soma-biased gene expression in

Drosophila melanogaster

adults. Genome Biol. 5:R40.

Perotti M-E, Cattaneo F, Pasini ME, Vernı` F, Hackstein JHP. 2001. Male

sterile mutant

casanova

gives clues to mechanisms of sperm–egg

interactions in

Drosophila melanogaster

. Mol Reprod Dev. 60:

248–259.

Poongothai J, Gopenath TS, Manonayaki S. 2009. Genetics of human

male infertility. Singapore Med J. 50:336–347.

Port F, Bullock SL. 2016. Augmenting CRISPR applications in

Drosophila

with tRNA-flanked sgRNAs. Nat Methods. 13:852–854.

Price CSC, Dyer KA, Coyne JA. 1999. Sperm competition between

Drosophila males involves both displacement and incapacita-
tion. Nature. 400:449–452.

Ramsko¨ld D, Wang ET, Burge CB, Sandberg R. 2009. An abundance of

ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome
sequence data. PLoS Comput. Biol. 5:e1000598.

Rappaport N, Twik M, Plaschkes I, Nudel R, Stein TI,

et al.

2017.

MalaCards: an amalgamated human disease compendium with
diverse clinical and genetic annotation and structured search.
Nucleic Acids Res. 45:D877–D887.

Ravi Ram K, Wolfner MF. 2007. Seminal influences:

Drosophila

Acps

and the molecular interplay between males and females during
reproduction. Integr Comp Biol. 47:427–445.

Skerget S, Rosenow MA, Petritis K, Karr TL. 2015. Sperm proteome

maturation in the mouse epididymis. PLoS One. 10:e0140650.

Snook RR, Karr TL. 1998. Only long sperm are fertilization-competent

in six sperm-heteromorphic

Drosophila

species. Curr Biol. 8:

291–294.

Soumillon M, Necsulea A, Weier M, Brawand D, Zhang X,

et al.

2013.

Cellular source and mechanisms of high transcriptome complex-
ity in the mammalian testis. Cell Rep. 3:2179–2190.

Spradling AC, Stern D, Beaton A, Rhem EJ, Laverty T,

et al.

1999. The

Berkeley Drosophila genome project gene disruption project: sin-
gle P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.
Genetics. 153:135–177.

Stelzer G, Rosen N, Plaschkes I, Zimmerman S, Twik M,

et al.

2016.

The GeneCards suite: from gene data mining to disease genome
sequence analyses. Curr Protoc Bioinform 54:1.30.1–1.30.33.

Takemori N, Yamamoto M-T. 2009. Proteome mapping of the

Drosophila melanogaster

male reproductive system. Proteomics. 9:

2484–2493.

Tanaka KM, Takahashi A, Fuse N, Takano-Shimizu-Kouno T. 2014. A

novel cell death gene acts to repair patterning defects in

Drosophila melanogaster

. Genetics. 197:739–742.

Yu J, Wu H, Wen Y, Liu Y, Zhou T,

et al.

2015. Identification of seven

genes essential for male fertility through a genome-wide associa-
tion study of non-obstructive azoospermia and RNA interferen-
ce-mediated large-scale functional screening in

Drosophila

. Hum

Mol Genet. 24:1493–1503.

Uhle´n M, Fagerberg L, Hallstro¨m BM, Lindskog C, Oksvold P,

et al.

2015. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347:
1260419.

Van Doren M, Williamson AL, Lehmann R. 1998. Regulation of zy-

gotic gene expression in

Drosophila

primordial germ cells. Curr

Biol. 8:243–246.

Vedelek V, Bodai L, Gre´zal G, Kova´cs B, Boros IM,

et al.

2018. Analysis

of

Drosophila melanogaster

testis transcriptome. BMC Genomics.

19:697.

Vibranovski MD, Lopes HF, Karr TL, Long M. 2009. Stage-specific ex-

pression profiling of

Drosophila

spermatogenesis suggests that

meiotic sex chromosome inactivation drives genomic relocation
of testis-expressed genes. PLoS Genet. 5:e1000731.

Wakimoto BT, Lindsley DL, Herrera C. 2004. Toward a comprehen-

sive genetic analysis of male fertility in

Drosophila melanogaster

.

Genetics. 167:207–216.

Walker MJ, Rylett CM, Keen JN, Audsley N, Sajid M,

et al.

2006.

Proteomic identification of

Drosophila melanogaster

male accessory

8 |

G3,

2021, Vol. 11, No. 8

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024

gland proteins, including a pro-cathepsin and a soluble

c

-glu-

tamyl transpeptidase. Prot Sci. 4:9.

Wasbrough ER, Dorus S, Hester S, Howard-Murkin J, Lilley K,

et al.

2010. The

Drosophila melanogaster

sperm proteome-II (DmSP-II). J

Proteomics. 73:2171–2185.

Wen K, Yang L, Xiong T, Di C, Ma D,

et al.

2016. Critical roles of long

noncoding RNAs in

Drosophila

spermatogenesis. Genome Res. 26:

1233–1244.

Wilhelm M, Schlegl J, Hahne H, Moghaddas Gholami A, Lieberenz M,

et al.

2014. Mass-spectrometry-based draft of the human prote-

ome. Nature. 509:582–587.

Wolfner MF. 1997. Tokens of love: functions and regulation of

Drosophila male accessory gland. Insect Biochem Mol. 27:
179–192.

Communicating editor: D. Begun

K. Ibaraki

et al.

| 9

Downloaded from https://academic.oup.com/g3journal/article/11/8/jkab183/6288452 by guest on 25 April 2024