1 

TITLE 

Long-Term Monolayer Cultivation Captures Homeostatic and Regenerative Features of 

Human Colonic Epithelial Cells 

 

Satoru Fujii,

1,2

 Yi Wang,

3

 Shanshan Meng,

1

 Ryan J. Musich,

1

 Scott T. Espenschied,

1

 

Kevin Newhall,

1

 Yi Han,

1

 Shuhei Sekiguchi,

2

 Ryoma Matsumoto,

2

 Matthew A. Ciorba,

4

 

L. David Sibley,

5

 Ryuichi Okamoto,

2

 Thaddeus S. Stappenbeck

1,6,*

 

 

1

Department of inflammation and immunity, Learner Research Institute, Cleveland 

Clinic, Cleveland, OH 44195, USA 

2

Department of Gastroenterology and Hepatology, Tokyo Medical and Dental 

University, Tokyo 113-8510, Japan 

3

Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 

Saint Louis, MO 63110, USA 

4

Division of Gastroenterology and the Inflammatory Bowel Diseases Center, 

Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, St. 

Louis, , MO 63110, USA 

5

Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine, St 

Louis, MO, 63110, USA. 

6

Lead contact 

*

Correspondence: stappet@ccf.org

 

 

 

 

2 

SUMMARY 

While organoid culture technique has significantly advanced research on intestinal 

epithelial cells (IECs), reproducing the homeostatic and regenerative processes of 

human IECs in vitro remains challenging. We previously established a unique long-

term 2-dimensional (2D) cultivation for mouse IECs using the air-liquid interface (ALI) 

technique, successfully recapitulating homeostasis and regeneration. Here, applying 

this to human IECs, we developed a long-term, self-organizing 2D cultivation for human 

IECs. During the culture, we observed a dynamic transition in cellular shape from 

squamous to columnar, resembling in vivo regeneration. RNA sequencing indicated 

that intestinal stem cells (SCs) with canonical SC markers like LGR5 may play a main 

role in both homeostasis and regeneration. Moreover, we identified minor populations, 

including deep crypt secretory (DCS)-like cells, CA7-positive cells, and non-canonical 

Goblet cells, previously overlooked in vitro. This novel technique holds promise for not 

only broadening our understanding of homeostasis, regeneration, and the functions of 

minor populations as well as SCs in human intestinal mucosa, but also facilitating 

future studies such as analyzing host-microbe interactions.

 

 

 

 

3 

INTRODUCTION 

The intestinal epithelium is a selectively permeable barrier which functions as the 

primary interface between the host and the milieu of microorganisms and nutrients which 

reside in or pass through the intestine.  In mammals, the intestinal epithelium is 

comprised of a monolayer of polarized cells including SCs, transient-amplifying (TA) cells, 

absorptive  enterocytes (ECs), goblet cells (GCs), enteroendocrine cells (EECs), and 

some minor populations such as  Tuft cells (TCs),  to  execute  multiple  functions  like 

digestion, absorption, and mucosal immunity. 

3-dimensional (3D) culture methods  using  primary  IECs  from mice  or  human 

donors were reported from several groups  a decade ago

1–4

.  While they  have  made 

revolutionary contributions in advancing basic and clinical science in this field, several 

limitations remain to be overcome. For example, recreating the regenerative process of 

IECs in 3D culture is challenging due to difficulties in maintaining cell viability after injury. 

We previously established a novel ALI cultivation method of mouse IECs which 

yielded self-organizing, long-term 2D cultures that could recapitulate homeostatic and 

regenerative  processes  of IECs

5

.  This enabled us to analyze regenerative IECs 

transitioning from injury-like squamous to homeostasis-like columnar morphologies, and 

consequently identified  Hopx

+

  cells as colitis-associated regenerative stem  cells 

(CARSCs)

5

. In our current study, we applied this technique to patient derived IECs for 

further understanding homeostasis and regeneration of human IECs from a new 

perspective. 

 

 

 

 

 

4 

RESULTS 

We applied our ALI culture technique to human colon epithelial cells derived from 

healthy  donors.  Briefly, dissociated human IECs prepared  from 3D spheroids  were 

seeded onto transwell membranes and submerged in L-WRN conditioned media with 

rock inhibitor (Y-27632) and TGF-beta inhibitor (SB 431542 or A83-01) for 5-7 days until 

confluency. Monolayers were subsequently exposed to air to establish ALI for up to 28 

days. Like mouse cells, we observed a continuous 2D  monolayer, but no crypt-like 

folding structures. The  monolayer  cells  were  squamous  with  no indication of cellular 

differentiation  at ALI day 0  (ALId0),  which  was  reminiscent of squamous epithelia 

commonly  observed in the region of crypt abscess  in  ulcerative colitis (UC)  patients 

(Figure S1A). They subsequently grew columnar which coincided with the emergence of 

GC-like and EC-like cells  by ALId7,  resembling  the homeostatic cellular structure of 

human colon as ALI culture progressed (Figure 1A). The cell height plateaued around 

40 

μ

m (Figure 1B), which is comparable to IEC height observed in human colon tissue

6

. 

Of note, while TGF-beta inhibitors are essential for 3D human IEC culture

3

, they were 

dispensable for the 2D monolayer cells.  Additionally,  these culture conditions were 

permissive for polarization and differentiation of IECs from the human small intestine

7

 

(Figure S1B). 

Immunofluorescence  staining  revealed  that  cultures  after  ALId7  contained 

common differentiated cell types including SLC26A3-positive ECs, MUC2-positive GCs, 

and  CHGA-positive  EECs  (Figure  1C),  while none of these  were observed  in the 

squamous monolayer at  ALId0.  Moreover, the  presence of an overlying mucus layer 

suggests GCs are functional in the system and may establish barrier properties sufficient 

 

 

5 

to protect cells from bacterial pathogens much like the mucosa 

in vivo

 (Figure S1C and 

S1D).  Transmission electron microscopy  (TEM)  analysis revealed  ultrastructural 

features of ECs, GCs, and EECs  (Figure 1D).  The  columnar  cells  at ALId28  can be 

passaged to both 2D ALI monolayers and 3D spheroids, demonstrating the existence of 

SCs in the monolayer even after 1 month culture (Figure S1E). EdU incorporation assays 

revealed  that  the IEC monolayer was hypo-proliferative at ALId0, transiently became 

hyper-proliferative around ALId2-d4, followed by a gradual return to be less proliferative 

thereafter (Figure 1E, S1F). 

 

Bulk  mRNA sequencing  (RNAseq)  at multiple time points showed 

dynamic transitions in gene expression during the ALI culture (Figure 1F). Canonical SC 

markers  (LGR5, OLFM4, ASCL2, SMOC2) and proliferation markers (MKI67, PCNA) 

peaked at ALId4, supporting the finding of the EdU analysis. This also suggests that SCs 

expressing the canonical markers, but not HOPX, mediate human IEC proliferation and 

differentiation. We also observed marked induction of transcription factors required for 

secretory  differentiation  (

ATOH1, SPDEF, NEUROG3

)  at ALId4, preceding  the 

emergence of GC and EEC markers.  EC markers  (CA1, CA4, SLC26A3)  followed  a 

similar pattern except for AQP8, a mature EC marker, which  emerged  at ALId7, 

suggesting that EC maturation may require a longer time compared to GCs and EECs 

under this condition. Quantitative PCR (qPCR) analysis of transcripts associated with 

SCs, proliferative, and differentiated cells with higher temporal resolution supported the 

bulk RNAseq findings (Figure 1I). Furthermore, gene set enrichment analysis (GSEA) 

revealed  that genes related to mouse IEC regeneration after  dextran sodium sulfate 

(DSS)-induced colitis were significantly  enriched in the squamous cells at ALId0 

 

 

6 

compared to ALId7, which aligned with the trends observed in mouse ALI cells

5

. (Figure 

1G). GSEA also indicated a significant correlation between a UC epithelial signature and 

the squamous cells at ALId0, and a healthy epithelial signature  and the homeostatic 

columnar cells at ALId7 (Figure 1H). Since we previously proposed that mouse ALI cells 

contains features as follows;  i)  squamous  cells at ALId0  mimic the characteristics of 

inflamed mucosa in  DSS-induced colitis, ii)  hyper-proliferative cells observed around 

ALId2-d4 replicate the regenerative mucosa recovering from injury, and iii)  columnar 

monolayer cells observed after ALId7 resemble the homeostatic mucosa

5

, the 

histological and transcriptional findings so far suggested that the human IEC ALI culture 

recapitulates the epithelial features of injury, regeneration, and homeostasis, as shown 

in the mouse model. 

We and another group previously reported that regenerating IECs adopt a fetal-

like expression profile, considered essential for inducing a regenerative program in mice 

IECs

8,5

.  GSEA revealed an  enrichment of fetal-like genes at ALId0  (Figure S1G), 

suggesting ALId0 cells  have  activated  a  regenerative  program  defined  in part by 

expression of fetal-like genes.  YAP signaling,  considered  crucial for SC expansion, 

regeneration, and induction of fetal-like genes, was assessed as well. GSEA showed a 

high enrichment of YAP target genes at ALId0 compared to ALId7 (Figure S1H). High 

expression of major YAP target genes at ALId0 and subsequent reduction were also 

observed (Figure S1I). These finding suggested that YAP signaling mainly functions in 

the survival of squamous IECs during the submerged culture period, rather than in SC 

expansion and regeneration.  WNT signaling  is  another  essential  pathway  for  SC 

maintenance. Most canonical WNT target genes exhibited higher expression at ALId0 

 

 

7 

and ALId4 than at later time points, suggesting a role for WNT signaling in regulating 

IECs survival and expansion during the early phase of ALI culture (Figure S1J). Of note, 

since WNT ligands are uniformly supplemented in the ALI culture media, WNT signaling 

of each IEC should be regulated independently of exogenous WNT gradient. Collectively, 

these findings suggest that the signaling of fetal-like genes, YAP, and WNT is associated 

with the cellular response during injury and regeneration in human IECs. 

To further dissect the transcriptomic heterogeneity of cultured human IECs, we 

performed single-cell RNA sequencing (scRNAseq) on three colon lines derived from 

healthy donors at ALId7, when cells have begun to differentiate and adopt a columnar 

morphology similar to what is observed in homeostasis. Uniform Manifold Approximation 

and  Projection  (UMAP)  clustering,  heatmap,  and dot plot  analyses  on  the integrated 

dataset  from the three lines  revealed  eleven  distinct clusters within  the  homeostatic 

columnar monolayer cells containing major lineages including SCs (Cluster #1), TA cells 

(#2), ECs (#3, #4), GCs (#5), and EECs (#10) (Figure 2A-C), while IEC 3D spheroids 

consisted of mostly a single large cluster (Figure S2A).  

 

SCs, defined by canonical SC markers including OLFM4 and LGR5 as in bulk 

RNAseq,  constituted a small cluster (#1) with differential expression of these genes 

(Figure 2D, 2F). LGR5, regarded as the most specific SC marker in both humans and 

mice, was distinctly expressed in this cluster, and  RNAscope 

in situ

  hybridization 

confirmed its expression within the monolayer cells. (Figure 2E).  Contrarily,  HOPX 

expression was minimal  across the clusters,  and quiescent or reserve SC markers 

(LRIG1, BMI1), which were defined in mice, showed expression profiles unspecific to the 

SC cluster  (Figure 2F, S2B). Considering these results  along  with  the  bulk RNAseq 

 

 

8 

findings, these non-canonical SC marker genes may not be relevant to SC functions in 

homeostasis or regeneration of human mucosa. Cell cycle analysis (Figure 2G) revealed 

that only 30% of SCs reside in S or G2M phase, which was consistent with previous 

scRNAseq studies on human IECs

9

 and mouse xenograft models

10

, suggesting slower 

cycling in human colonic SCs compared to mice. TA cells, identified by MKI67 and PCNA, 

exhibited a fast cell cycle with 90% of them residing in S or G2M phase (Figure 2G). 

PCNA-positive cells are mainly in S phase, whereas MKI67-positive cells are in G2M 

phase, indicating a possible subdivision of TA cells based on cell cycle differences. 

(Figure S2C-S2D). 

 

We  assigned  GC  population  (#5)  based on  the expression of canonical  GC 

markers  such as MUC2,  TFF3,  and  FCGBP.  We  also  assigned two sub-clusters 

neighboring the GC cluster to GC-sub1 and GC-sub2. The overall expression profile of 

GC-sub1 cells closely resembles that of GCs, with somewhat higher mitochondrial gene 

ratio (Figure S2E), suggesting that GC-sub1 cells may represent a stressed or dying 

population of GCs. Conversely, distinct differences in gene expression were observed 

between GC-sub2 and the others, as GC-sub2 cells expressed specific genes like REG4 

and AGR2 (Figure 2B-2C, S2K). These genes are reported as markers for DCS cells in 

mice

11–13

, leading us to designate this as DCS-like cluster.  

 

In addition to canonical GCs, recent studies indicated the presence of non-

canonical GCs (nc-GCs), which show enriched expression not only of GC markers but 

also of EC-associated genes

14

. Examining the small cluster (#8) near the GC cluster (#5), 

we identified the co-expression of several EC markers including SLC26A3 along with GC 

markers in this cluster. Therefore, we assigned this to nc-GC cluster. Pathway analysis 

 

 

9 

of GC cluster genes revealed a biosynthesis signature of mucin type o-glycan, a major 

component of intestinal mucin  (Figure 2H)

15

.  In contrast, pathway analysis of nc-GC 

cluster genes indicates an association with mineral absorption, a major function of ECs 

(Figure 2I)

16

. These findings demonstrate distinctive functions between GCs and nc-GCs 

in the human mucosa. We specifically observed the expression of PLCG2 in this cluster 

(Figure 2B-2C, S2F), suggesting PLCG2 as a candidate marker for nc-GCs. 

We previously reported BEST4-positive cells as a lineage of mature absorptive 

enterocytes in humans

17

. Intriguingly, cells in cluster #9 expressed  distinctive genes 

including BES4, OTOP2, CA7, and NOTCH2, which were reported to be expressed in 

the BEST4-positive cells

18

. We observed more uniform expressions of CA7 than BEST4 

in this cluster  (Figure S2G), promoting us to assign this to CA7 cluster. RNAscope 

analysis detected a CA7-positive population in both ALI cells and human colonic tissues 

(Figure 2J), affirming the reliability of our scRNAseq analysis in identifying this minor 

population 

in vitro

. We also verified the high expression of SPIB, a transcription factor 

crucial for M cell differentiation in mice

19

, within this cluster (Figure S2H). Subsequent 

analysis uncovered the preferential expression of GP2, a recognized M cell marker and 

target gene of SPIB

19

, in this cluster (Figure S2H). This observation lends support to the 

hypothesis that the  SPIB  expression  may be associated with the induction of CA7-

positive cells.

 

In human IECs, EECs consist of sub-populations that produce different types of 

hormones.  Additional  transcriptomic  investigation  into  ECC  cluster  (#10)  revealed 

presence of  L-cells,  expressing  PYY  and glucagon,  enterochromaffin  cells  (ECs), 

expressing  TPH1, and progenitor cells expressing NEUROG3  (Figure 2K, S2I-S2J). 

 

 

10 

Immunofluorescence of NEUROG3, Serotonin (EC marker), and GLP-1 (L-cell marker) 

in ALId7 cells corroborated this scRNAseq analysis (Figure 2L). Of note, a subset of 

EECs  in    ALId7 monolayer cells  exhibits  distinctive  SST  expression, indicating the 

presence  of  D-cells  (Figure 2K-2L, S2I), which  previous scRNAseq studies failed to 

identify  in human colon  tissue or organoids

18,20,21

.  Consistently, this  corroborates  the 

notion  that the ALI cultured  cells  faithfully replicate 

in  vivo

  differentiation programs, 

yielding minor populations of the human colon.  

In addition, we  identified  a small cluster  (#11)  with  distinctive  expression of 

TRPM5, a putative maker for Tuft cells (TCs). Consequently, we assigned this to Tuft 

cell cluster. Genes such as PTGS1, TAS1R3, and POU2F3, enriched in this cluster, can 

be promising markers for labeling TCs in human intestinal mucosa (Figure 2C).  

In summary, human colonic monolayer cells at ALId7 recapitulated the 

homeostatic biology of human colonic epithelial mucosa. The observed transition from 

squamous cells at ALId0 to columnar cells at ALId7 will provide valuable insights into the 

cellular plasticity crucial for IEC regeneration after injury. Also, the homeostatic columnar 

ALI cells contain not only major populations, but also minor populations such as DCS-

like cells, nc-GCs, CA7-positive cells, and D-cells.  Thus, this ALI culture technique 

emerges as a fundamental tool for studying human mucosal physiology in homeostasis, 

regeneration mechanisms, and the pathophysiology of intestinal diseases including 

inflammatory bowel disease. 

 

DISCUSSION 

 

We established a long-term, self-organizing monolayer culture for IECs 

 

 

11 

from human colon. We observed the dynamic transition in cellular shape from squamous 

at  ALId0 to columnar at  ALId7, which was reminiscent of IEC regenerative  process 

recovering to homeostasis 

in vivo

. Transcriptome analyses of human ALI cells suggest 

that cells expressing canonical SC markers, such as LGR5 and OLFM4, presumably 

play a key role in both homeostasis and regeneration in human IECs. This is in contrast 

to HOPX, which we previously identified using mouse ALI culture as a CARSC gene 

crucial for IEC regeneration in mice. While human IECs in ALI culture exhibited almost 

similar behavior to mouse cells, this different expression pattern  of SC markers 

represented one of few discrepancies between human and mice ALI cells, underscoring 

a clear distinction in SC functions between the two. 

GSEA analyses revealed fetal-like  and  YAP  target genes were enriched in 

squamous cells at ALId0. YAP signaling is widely accepted to potentiate inductions of 

fetal-like genes and trigger a regeneration program in mice

8,22

. Our results supported the 

notion that the same phenomenon could be induced in the human colon. These signaling 

pathways may be crucial for inducing reprogramming necessary for the cellular shape 

transition to squamous during submerge culture, rather than for IEC expansion in the 

early stage of ALI culture. Focusing on WNT signaling, human IECs intriguingly appeared 

to possess an auto-regulation system for WNT signaling, as cellular responses 

transitioned during ALI culture despite the uniform supplementation of exogenous WNT 

ligands. 

 

In addition to delineating the  distinct  separation of  major  IEC  populations, 

scRNAseq analysis of the human homeostatic IECs monolayer unexpectedly detected 

several minor populations, some of which were not identified in previous reports. BEST4-

 

 

12 

positive cells, which we  previously reported as  a sub-population of absorptive 

enterocytes in human colon epithelia

17

, formed a definite population within the monolayer 

cells. Compared to BEST4, CA7 appears to be a more specific marker, and we also 

confirmed the presence of CA7-positive cells in human colon tissue, which prompted us 

to designate this as CA7 cluster, rather than BEST4 cluster. Given recent reports linking 

BEST4 to the pathophysiology of IBD

18

  and colorectal cancer

23

,  conducting further 

research on the CA7 cluster using this ALI technique would be instrumental in advancing 

this area of study. 

 

DCS cells were previously identified in mice to produce SC niche factors including 

EGF, DLL1, and DLL4 for supporting SC maintenance

11–13

, but their existence in humans 

was not confirmed yet.  We  identified  DCS-like cells  differentially  expressing  DCS 

markers like REG4 and ARG2 in human IECs for the first time (Figure S2K). We also 

confirmed the non-exclusive  expression  of  DLL1  and  DLL4, but little of  EGF,  in the 

cluster (Figure S2L). Since our current understanding of this cluster is limited, additional 

analyses  using this ALI technique will contribute to our future  understanding  of  the 

functions of DCS-like cells. 

The identification of the nc-GC population, recently characterized by the 

expression of both secretory-lineage and enterocyte markers

14

, was another unexpected 

finding. Our UMAMP analyses suggest that while the GC and nc-GC populations cluster 

similarly, they possess distinct differences in their functions. Since the function of nc-

GCs remains largely unknown, our monolayer culture is poised to make a significant 

contribution to clarifying their role. 

While our ALI technique holds promise for further studies on human IECs, such 

 

 

13 

as 1) analyzing the interaction between human IECs and pathogens

7

 or immune cells, 

and 2) exploring potential medications to control human IEC regeneration, it is essential 

to acknowledge certain limitations,  including: 1) the inability to reproduce crypt-like 

folding structures, and 2) the experimental condition of direct exposure of cells to air, 

which  differs  from the actual physicochemical environment 

in vivo

.  We  also  need to 

consider the possibility that ALId7 cells may not have reached full differentiation when 

interpreting the scRNAseq results.  

In  conclusion, the newly developed monolayer culture system faithfully 

recapitulates the 

in vivo

 epithelial structure of the human colon in both homeostasis and 

regeneration. Its future applications hold promise for expanding our understanding of the 

human intestine in health and disease. 

 

 

 

 

14 

Figure 1. Establishing 

In Vitro

  Culture of a Self-Organizing Human Colonic 

Epithelial Monolayer Using Air-Liquid Interface Culture Technique 

(A) Hematoxylin and Eosin (H&E) images of human colon monolayer cells at day 0, 4, 7, 

and 14 of ALI culture. Representative images of six rectum lines (n = 6). Scale bar: 50 

μm. 

(B) Cell height was quantified and plotted to compare ALId0 and ALId7. n = 4 rectum 

lines. Mean values ± SD are shown. Mann-Whitney U test: *p < 0.05. 

(C) Sections of ALId7 monolayers stained for VIL1 (brush border marker), SLC26A3, 

MUC2, and CHGA. Representative images of three rectum lines (n =3). Scale bar: 50 

μm. 

(D) Transmission electron microscopy images showed the morphology of enterocytes 

(left panel), goblet cells (middle panel), and enteroendocrine cells (outlined with dashed 

line) with secretory granules (arrowhead) (right panel) at ALId7 or d14. Representative 

images of three rectum lines (n =3). Scale bar: 5 μm. 

(E) The proliferation rate assessed by EdU positive cells per field in the human colon 

monolayer cells at ALI day 0, 1, 2, 4, and 7. n = 3 rectum lines. Mean values ± SD are 

shown. Ordinary one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons test: *p < 0.05; **p 

< 0.005; ***p < 0.0005. 

(F) Heatmap analysis of major cell markers of SCs, TA cells, secretory progenitor cells, 

ECs, GCs, and EECs at various time points of ALI culture. n = 3 technical replicates per 

time point, except for n = 2 at ALI day 21. 

(G) GSEA-based analysis of genes associated with the regenerative IECs in DSS-

induced colitis in cells at ALI day 0 compared with those at ALI day 7. Normalized 

 

 

15 

enrichment scores (NES) and false discovery rates (FDR) are shown. 

(H) GSEA-based analysis of the upregulated genes of colonic epithelium in UC patients 

compared with healthy donors (upper) and vice versa (lower), in cells at ALI day 0 

compared with those at ALI day 7. NES and FDR are shown. 

(I) Expression of LGR5, MKI67, AQP8, MUC2, and CHGA, defined by qPCR, in human 

colon monolayers at ALI day 0, 2, 4 and 7. Results were normalized to the day 0. Mean 

values ± SD were shown. n = 3  rectum  lines/time point. Ordinary one-way ANOVA 

multiple comparisons: *p < 0.05; **p < 0.005; ***p < 0.0005; ****p < 0.0001.  

 

 

 

 

16 

Figure 2. Transcriptomic Analysis of the Human IEC monolayer by Single-Cell 

Resolution Capturing Cellular Heterogeneity Resembling Homeostatic 

in-Vivo

 

Mucosa 

(A-C) UMAP clustering (A), heatmap (B), and dot plot (C) of scRNAseq analysis of 

human colonic monolayer cells at ALI day 7 to represent top differentially expressed 

genes in each cluster, integrated out of three rectum lines (n = 3) derived from healthy 

donors.  

(D) UMAPs of canonical SC markers (LGR5, OLFM4, ASCL2, SMOC2) derived from 

(A). 

(E) 

In situ

  hybridization image of LGR5 RNA by RNAscope in the human colon 

monolayer cells at ALI day 7. A representative image of three rectum lines (n =3). Scale 

bar: 50 μm. 

(F) Dot plot of canonical SC markers (LGR5, OLFM4, ASCL2, SMOC2) analyzed with 

(C). 

(G) Bar graph of cell cycle analysis to represent proportion of cells in G1, G2M, or S 

phase. 

(H-I) Pathway analysis to represent the top 6 upregulated pathways in the GC (H) and 

nc-GC (I) clusters. The top 150 differentially expressed genes in each cluster were used 

in this analysis.  

(J) 

In situ

 hybridization image of CA7 RNA by RNAscope in the human colon monolayer 

cells at ALI day 7 (upper panel) and human colon surgical tissue (lower panel). 

Representative images of three rectum lines (n =3).  Scale bar: 50 μm. 

(K) Sub-clustering of the EEC cluster. UD (undifferentiated) represents cells expressing 

 

 

17 

no specific EEC subcluster markers. Stressed_Dying represents cells with higher 

mitochondrial gene ratio than the others (Figure S2J). 

(L) Immunofluorescence of NEUROG3, 5HT, GLP-1, and SST in the human colon 

monolayer at ALI day 7. Representative images of three rectum lines (n =3).  Scale bar: 

50 μm. 

 

 

 

18 

STAR+METHODS 

RESOURCE AVAILABILITY 

Lead Contact 

Further information and requests for resources and reagents should be directed to and 

will be fulfilled by the lead contact, Thaddeus S. Stappenbeck (stappet@ccf.org). 

Material Availability 

This study did not generate new unique reagents. 

Data and Code Availability 

Bulk and single-cell RNAseq data have been deposited at GEO and are publicly available 

as of the date of publication. Accession numbers are listed in the key resources table. 

EXPERIMENTAL MODEL AND SUBJECT DETAILS 

Human Colonic Spheroid Lines 

Human colonic crypts from healthy donors were obtained during routine endoscopy at 

the Washington University School of Medicine in collaboration with the Washington 

University Digestive Diseases Research Core Center (DDRCC) or at the Tokyo Medical 

and Dental University Hospital. This study was approved by the Washington University 

Institutional Review Board, Cleveland Clinic Institutional Review Board, and the Tokyo 

Medical and Dental University Scientific Ethics Committee. Written informed consent was 

obtained from all donors. The isolated crypts were collected and cultured as previously 

described

3

. In brief, to isolate crypt, biopsies were minced with fine scissors and digested 

in 1 mL of 2 mg/mL collagenase type I solution with 50 μg/mL gentamicin in washing 

media (DMEM/F12 supplemented with 1X L-glutamine, 1X penicillin/streptomycin and 

10% FBS) for 20-30 min with pipetting every 5-10 min. Crypts were filtered through a 70-

 

 

19 

μm  strainer,  incubated  with  9  mL  of  ice-cold washing media and pelleted by 

centrifugation at 300 g for 5 min. Pelleted crypts were then suspended in 1 mL washing 

medium, transferred to a 1.5 mL tube and pelleted by centrifugation at 200 g for 5 min. 

The supernatant was carefully removed by pipette, and the pellet was re-suspended in 

Matrigel. The Matrigel mixture was plated into 24-well tissue culture plates on ice. Plates 

were flipped upside down  and incubated at 37°C to polymerize the Matrigel and 500 μL 

of 50% L-WRN CM, a 50/50 mixture of L-WRN CM and fresh primary culture media 

(Advanced DMEM/F-12 supplemented with 20% fetal bovine serum, 1x L-glutamine or 

GlutaMax, 1x penicillin/streptomycin), supplemented with 10 μM Y-27632 and 10 μM SB 

431542, was added to each well. Media was refreshed every 2-3 days. Grown spheroids 

were collected in Cell Recovery Solution, digested by TrypLE Express into small 

fragments, and passed every 3-4 days. These human colonic spheroid lines were 

maintained and passed up to 30 generations for the experiments in this paper.  

Human Tissue 

Formalin-fixed paraffin blocks of colonic surgical resection from non-IBD donors as 

healthy controls and UC patients were obtained from Department of Pathology and 

Immunology at the Washington University in St. Louis or Lerner Research Institute 

Biorepository Core at Cleveland Clinic. Five micro-meter sections from these blocks were 

stained for H&E, immunofluorescence, or RNAscope-based in situ hybridization. 

 

METHODS DETAILS 

ALI culture experiments 

Grown human colonic spheroids were dissociated into single cells by TrypLE Express 

 

 

20 

digestion and seeded onto transwells pre-coated with 10% Matrigel diluted in PBS for 

20min. 200,000 cells were seeded per well. Initially, 150 μL and 350 μL of 50% L-WRN 

media with 10uM Rock inhibitor (Y-27632) and TGF beta inhibitor (SB 431542) were 

added into the upper and lower chambers, respectively, to let the cells submerged in 

media for 5-7 days until they become confluent. Medium in the upper chamber was then 

removed to create an air-liquid interface. Cells were grown in ALI with 50% L-WRN 

medium (no Rock inhibitor or TGF beta inhibitor supplemented) in the bottom chamber 

for an additional 7-28 days to reach maturity with medium change every two or three 

days.  

Histology 

ALI cultured cells were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) for 30min at room 

temperature. The fixed cells were then dehydrated in 70% ethanol and were embedded 

in 2% agar followed by paraffin embedding, sectioning, and staining. Bright field 

histological images were acquired with an Olympus BX51 microscope. Cell height was 

quantified by averaging measurements from two slides per time point for each donor 

sample using the cellSens Imaging software. 

 

Immunostaining 

Slides were de-paraffinized and subjected to heat-induced antigen retrieval in Trilogy 

solution for 20min. Slides were blocked in PBS containing 2% BSA, 5% serum and 0.1% 

Triton-X for 1hr at room temperature, and then treated with primary antibodies at desired 

dilutions overnight at 4°C. They were then washed 3 times in PBS and incubated with 

secondary antibodies conjugated with desired fluorophores for 1 h at room temperature. 

 

 

21 

Fluorescent images were acquired with a Zeiss Axiovert 200M or a Zeiss Axio Observer 

7 inverted microscope. ImageJ was used to uniformly adjust brightness and contrast. 

Information about primary antibodies and dilution used in the assay can be found in the 

key resources table and supplementary table S1, respectively. 

Transmission electron microscopy 

Cultures grown on transwell inserts were washed once in PBS, then fixed overnight at 

4°C in 2.5% Glutaraldehyde + 4% Paraformaldehyde in 0.2M Sodium Cacodylate Buffer 

(pH 7.4). Fixative was removed and samples were stored in 0.2M Sodium Cacodylate 

Buffer at 4°C until further processing. Transwell membranes were removed from inserts, 

cut in half, then embedded in Eponate 12 Resin. Sections were cut with a Leica EM UC7 

ultramicrotome. Semi-thin sections were transferred to glass microscope slides, stained 

with toluidine blue and imaged with an Olympus BX43 microscope equipped with a DP22 

camera using 20x (NA), 40x (NA), and 63x (NA) objectives. Thin (200 nm) sections were 

stained with osmium tetraoxide and uranyl acetate, transferred to copper grids, and 

imaged using an FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN transmission electron microscope 

equipped with an 11 megapixel Orius 832 CCD camera.  Operating voltages were held 

constant within imaging sessions. 

EdU incorporation assay 

ALI monolayer cells were treated with 10mM EdU for 3hrs and then fixed in 4% PFA for 

30min at room temperature. EdU signal detection was performed according to the 

manufacturer’s manual of the Click-iT EdU Cell Proliferation Kit or EdU Assay/EdU 

Staining Proliferation Kit. Samples were counterstained with Hoechst 33342, then whole 

mounted on glass microscope slides using Vectashield Vibrance mounting medium or 

 

 

22 

Vectashield mounting medium. Slides were imaged using a Zeiss Axio Observer 7 

inverted microscope or an Olympus FV3000 confocal microscope. ImageJ was used to 

uniformly adjust brightness and contrast. Quantification was conducted by two blinded 

independent investigators. 

Quantitative PCR 

RNA was extracted from ALI cells using the RNeasy Micro Kit according to 

manufacturer's directions. Briefly, ALI cells were harvested in RLT buffer with 2-

mercaptoethanol and stored in -80°C until use. RNA was extracted and eluted in 14ul of 

nuclease free water and stored at -80°C until use. RNA was quantified on Cytation 5 by 

diluting 1:1 with nuclease free water to determine the volume of RNA needed to convert 

to cDNA. cDNA was prepared using 1ug of starting RNA and using iScript reverse 

transcriptase kit according to manufacturer’s directions. Quantitative PCR reaction was 

conducted with TB Green Advantage qPCR 2X- premix using a Bio-Rad CFX Connect 

Real-Time PCR Detection System. Primers were validated for specificity using a water 

control and conducting melt curve analysis. Data were analyzed using the Delta-Delta 

Ct method. Primer sequences for quantitative PCR used in this study are as follows; 

LGR5-forward: CCTTCATAAGAAAGATGCTGGAAT, LGR5-reverse: 

GTTTAATGGGGGAAATGTACAGAG; MKI67-forward: 

AAGAGAGTGTCTATCAGCCGAAGT, MKI67-reverse: 

GTGGCCTGTACTAAATTGACTGTG; AQP8-forward: GCCTGTCGGTCATTGAGAAT, 

AQP8-reverse: AGGGTTGAAGTGTCCACCAC; MUC2-forward: 

AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG, MUC2-reverse: 

TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT; and CHGA-forward: 

 

 

23 

AGAATTTACTGAAGGAGCTCCAAG, CHGA-reverse: 

TCCTCTCTTTTCTCCATAACATCC. 

RNAscope based 

in situ

 hybridization 

ALI culture cells were fixed in 4% PFA for 30 min at room temperature and sequentially 

dehydrated in 10, 15 and 20% sucrose in PBS, and frozen in Tissue-Tek OCT compound. 

Five micron-thick cryosections were used for RNAscope based in situ hybridization 

according to protocols recommended by the manufacturer of RNAscope Multiplex 

Fluorescent Reagent Kit v2 (ACDBio). See the key resources table for details about 

probes used in the assays.

 

 

Bulk RNA sequencing 

ALI cells were harvested as described for quantitative PCR. Total RNA quality was tested 

by Bioanalyzer. The RNA-Ribo-Zero method was employed for cDNA library construction. 

Sequencing datasets produced using an Illumina HiSeq3000 instrument were analyzed 

as follows. Reads were aligned to the reference human genome using STAR software 

(v2.7.8a). Gene counts were derived from uniquely aligned reads. To identify 

differentially expressed genes, DESeq2 package (v1.40.2) was used to calculate fold 

changes, p-values using a Wald test and adjusted using Benjamini-Hochberg correction. 

For pathway analysis, differentially expressed gene lists were analyzed by using 

g:Profiler through the gprofiler2 package (v0.2.2). 

Sample preparation for scRNAseq 

ALI transwells were washed by 1X DPBS-EDTA (0.05mM) once and incubated in TrypLE 

Express Enzyme at 37 °C for 25-30 mins, then pipetted 10 times with P1000 pipette and 

collected into a 15ml conical tube. Incubate the cell suspension at 37°C until the cells 

 

 

24 

mostly dissociate into singlets. The dissociated cell suspension was filtered through 20 

μM strainer to purify cell singlets. Denovix CellDro FL automated cell counter was used 

to evaluate viability and singlet percentage of the prepared cell singlets. If necessary, 

the prepared cell singlets were sorted with BD FACS Melody Flow Cytometer by using 

Propidium Iodide and DRAQ5 double staining. Eventually, the prepared cell singlets from 

ALI (viability≥70%, singlet percentage≥70%) were immediately processed by following 

10X Single Cell 3' Reagent Kits V3.1 Next GEM protocol (document # CG000204). 

Initially, 10,000 single cells were targeted using the Chromium Controller for cDNA 

synthesis and barcoding. Subsequent steps involved evaluating cDNA quality and 

quantity with a Bioanalyzer High Sensitivity DNA assay. The cDNA served as the 

foundation for fragmentation, end-repair, adapter ligation, and sample indexing. 

Bioanalyzer assays ensured proper library construction. Libraries were pooled, 

quantified using a Quantabio Q cycler, denatured, and sequenced on an Illumina 

Novaseq 6000 platform. The sequencing protocol comprised 28 cycles for the forward 

read and 91 cycles for the reverse read. 

scRNAseq data processing 

Sequence data were mapped onto the human genome (GRCh38) using CellRanger 

(v7.0.1) using default parameters. For downstream analysis, filtered gene-barcode 

matrices generated by CellRanger were read into the Seurat package (v5.0.0) on R 

(v4.3.0)/RStudio (v2023.09.1+494) (Butler et al., 2018; Cao et al., 2019; Trapnell et al., 

2014). Plots generated from RStudio were adjusted with ggplot2 and processed with 

Adobe Illustrator CC. In Seurat, dead cells with high mitochondrial ratios (>20%) and 

potential doublets with high total transcript counts (>20,000) were first filtered out. The 

 

 

25 

resulting data were normalized using SCTransform with default parameters. The top 

3,000 most variable features were calculated, and integration was performed to remove 

patient-to-patient variance for clustering. The first 40 PCs were used for graph-based 

clustering, which was visualized with UMAP-based dimensional reduction (Becht et al., 

2018). Marker genes for each cluster were calculated using the wilcoxauc function from 

the presto package (v1.0.0). Visualization of gene expression was performed using 

various functions within the Seurat package, i.e. FeaturePlot, DoHeatmap, DotPlot, etc. 

ALI co-culture with 

Shigella flexneri

 

Shigella flexneri 

Castellani and Chalmers (M90T Sm) was cultured in TSB media to be 

its density at OD600 = approximately 1.0. the bacterial culture was pelleted at 3500G for 

3 minutes and the bacterial palette was resuspended in 2 ml of advanced DMEM with 20 

mM HEPES. 100 uL of the bacterial suspension was applied to ALId19 monolayer cells. 

Spin down the co-culture at 500G for 5 mins, then aspirate the bacterial suspension to 

restart ALI culture. After 24 hours of co-culture, the cells were fixed and processed for 

immunostaining.   

 

 

 

 

26 

Key resources table 

REAGENT or RESOURCE 

SOURCE 

IDENTIFIER 

Antibodies 

Rabbit monoclonal anti-Villin antibody (SP145) 

Abcam 

Cat#ab130751; 

RRID: 

AB_11159755 

Rabbit polyclonal anti-SLC26A3 antibody 

Novus Biologicals 

Cat#NBP1-84450; 

RRID: 

AB_11031898  

Mouse monoclonal anti-MUC2 antibody (F-2) 

Santa Cruz 

Biotechnology 

Cat#sc-515032; 

RRID: 

AB_2815005 

Rabbit polyclonal anti-Chromogranin A antibody 

Abcam 

Cat#ab15160; 

RRID: AB_301704 

Goat polyclonal anti-5-HT antibody 

ImmunoStar 

Cat#20079; RRID: 

AB_10719366 

Rabbit polyclonal anti-GLP-1 antibody 

Bioss 

Cat#BS-0038R; 

RRID: 

AB_10855332 

Rabbit polyclonal anti-Neurogenin 3 antibody 

Bioss 

Cat#BS-0922R; 

RRID: 

AB_10856983 

Rabbit polyclonal anti-SST antibody 

Sigma-Aldrich 

Cat#HPA019472; 

RRID: 

AB_1857360

 

Mouse monoclonal anti-beta-Catenin antibody 

BD Bioscience 

Cat#610153; 

RRID: 

AB_397554 

Rabbit polyclonal anti-Shigella antibody 

Abcam 

Cat#ab65282; 

RRID: 

AB_1142846 

Alexa Fluor 488 donkey polyclonal anti-rabbit 

IgG (H+L) 

Thermo Fisher 

Scientific 

Cat#A-21206; 

RRID: 

AB_2535792 

Alexa Fluor 488 donkey polyclonal anti-mouse 

IgG (H+L) 

Thermo Fisher 

Scientific 

Cat#A-21202; 

RRID: AB_141607 

Alexa Fluor 488 donkey polyclonal anti-goat 

IgG (H+L) 

Thermo Fisher 

Scientific 

Cat#A-11055; 

RRID: 

AB_2534102 

Alexa Fluor 594 donkey polyclonal anti-rabbit 

IgG (H+L) 

Thermo Fisher 

Scientific 

Cat#A-21207; 

RRID: AB_141637 

Bacterial and virus strains  

Shigella flexneri

  Castellani and Chalmers (M90T 

Sm) 

ATCC 

Cat#BAA-2402 

Biological samples 

 

 

27 

Formalin-fixed paraffin blocks of colonic 

resection/biopsy samples derived from healthy 

donors 

Washington 

University in St. 

Louis Department of 

Pathology & 

Immunology, 

Cleveland Clinic 

Lerner Research 

Institute 

Biorepository Core 

N/A 

Chemicals, peptides, and recombinant proteins 

Advanced DMEM/F12 

Gibco 

Cat#12634010 

DMEM/F12 

Sigma-Aldrich 

Cat#D6421 

HEPES 

Gibco 

Cat#15630080 

Gentamicin solution 

Sigma-Aldrich 

Cat#G1272 

L-glutamine, 100X 

Sigma-Aldrich 

Cat#G7513 

GlutaMAX Supplement 

Gibco 

Cat#35050061 

Collagenase, Type I, powder 

Gibco 

Cat#17100017 

Fetal Bovine Serum 

Sigma-Aldrich 

Cat#F2442 

Matrigel 

Corning 

Cat# 354234 

Y-27632 dihydrochloride 

R&D Systems 

Cat#1254 

SB 431542 

R&D Systems 

Cat#1614 

A83-01 

Tocris 

Cat#2939 

Cell Recovery Solution 

Corning 

Cat#354253 

TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red 

Gibco 

Cat#12605010 

Trilogy 

Sigma-Aldrich 

Cat#920P 

Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M, pH 7.4 

Electron Microscopy 

Sciences 

Cat#11652 

Eponate 12 Resin 

Pelco 

Cat#18012 

Hoechst 33342 

Sigma-Aldrich 

Cat#B2261 

Vectashield Vibrance mounting medium 

Vector Laboratories  Cat#H-1700 

Vectashield mounting medium 

Vector Laboratories  Cat#H-1000 

Tissue-Tek OCT compound 

Sakura 

Cat#4583 

Critical commercial assays 

RNeasy Micro Kit 

QIAGEN 

Cat#74004 

NucleoSpin RNA, Mini kit for RNA purification 

MACHEREY-

NAGEL 

Cat#740955 

iScript Reverse Transcription Supermix for RT-PCR  Bio-Rad 

Cat#708841 

TB Green Advantage qPCR Premix 

Takara 

Cat#639676 

RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 

ACDBio 

Cat#323100 

RNAscope Probe- Hs-LGR5 

ACDBio 

Cat#311021 

RNAscope Probe- Hs-CA7 

ACDBio 

Cat#431961 

Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa 

Fluor 488 dye 

Thermo Fisher 

Scientific 

Cat# C10337 

EdU Assay / EdU Staining Proliferation Kit (iFluor 

488) 

Abcam 

Cat#ab219801 

Deposited data 

Raw data files for bulk RNA sequencing 

This paper 

GEO: 

Raw data files for single-cell RNA sequencing 

This paper 

GEO: 

 

 

28 

Experimental models: Cell lines

 

L-WRN 

ATCC 

Cat#CRL-3276 

Oligonucleotides

 

qPCR primers, see also in Method Details 

This paper 

N/A

 

Software and algorithms 

Enrichr 

Ma’ayan Laboratory, 

Icahn 

School of Medicine 

at 

Mount Sinai, New 

York, NY; 

Chen et al., 2013; 

Kuleshov 

et al., 2016 

https://amp.pharm.

mssm.edu/Enrichr/ 

ImageJ 

NIH 

https://imagej.nih.g

ov/ij/ 

cellSens Imaging Software 

Olympus 

Standard v3.2 

Graphpad Prism 9 

Graphpad 

https://www.graph

pad.com/scientifics

oftware/ 

prism/ 

Other 

Cytation 5 

BioTek 

N/A 

CFX Connect Real-Time PCR Detection System 

Bio-Rad 

N/A 

 

 

 

 

29 

ACKNOWLEDGEMENTS 

This work was supported by the Crohn’s & Colitis Foundation. We thank the 

Biorepository Core, Genomics Core, Flow Cytometry Core, and Imaging Core, Cleveland 

Clinic Lerner Research Institute, and the Genome Technology Access Center and 

Digestive Disease Research Core Center, Washington University in Saint Louis.  

 

AUTHOR CONTRIBUTIONS 

T.S.S. conceptualized and supervised the study. S.F and Y.W. designed the study. S.F. 

performed and analyzed the data for most of the experiments. S. M. assisted with 

scRNAseq experiments. R.J.M performed the bioinformatics analysis. S.T.E., K.N., Y.H., 

S.S., and R.M. assisted with RNAscope and EdU assay. M.A.C, L.D.S, and R.O. 

provided  scientific  feedback.  S.F.  and T.S.S. wrote the manuscript. All authors 

contributed to the critical review of the manuscript. 

 

DECLARATION OF INTERESTS 

T.S.S. is on the scientific advisory board for Janssen Pharmaceuticals and Amgen. T.S.S. 

is a founder of Mobius Care, Inc. 

 

 

 

 

 

 

30 

REFERENCES 

1.  Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C.T., Yamaguchi, T.P., and Stappenbeck, T.S. (2012). 

Wnt5a Potentiates TGF-β Signaling to Promote Colonic Crypt Regeneration After 

Tissue Injury. Science 

338

, 108–113. 10.1126/science.1223821. 

2.  Sato, T., Vries, R.G., Snippert, H.J., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D.E., 

van Es, J.H., Abo, A., Kujala, P., Peters, P.J., et al. (2009). Single Lgr5 stem cells 

build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 

459

, 262–

265. 10.1038/nature07935. 

3.  VanDussen, K.L., Marinshaw, J.M., Shaikh, N., Miyoshi, H., Moon, C., Tarr, P.I., 

Ciorba, M.A., and Stappenbeck, T.S. (2015). Development of an enhanced human 

gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut 

64

, 

911–920. 10.1136/gutjnl-2013-306651. 

4.  Yui, S., Nakamura, T., Sato, T., Nemoto, Y., Mizutani, T., Zheng, X., Ichinose, S., 

Nagaishi, T., Okamoto, R., Tsuchiya, K., et al. (2012). Functional Engraftment of 

Colon Epithelium Expanded in Vitro from a Single Adult Lgr5+ Stem Cell. Nat. Med. 

18

, 618–623. 10.1038/nm.2695. 

5.  Wang, Y., Chiang, I.-L., Ohara, T.E., Fujii, S., Cheng, J., Muegge, B.D., Ver Heul, A., 

Han, N.D., Lu, Q., Xiong, S., et al. (2019). Long-Term Culture Captures Injury-Repair 

Cycles of Colonic Stem Cells. Cell 

179

, 1144-1159.e15. 10.1016/j.cell.2019.10.015. 

6.  Jenkins, D., Goodall, A., Drew, K., and Scott, B.B. (1988). What is colitis? Statistical 

approach to distinguishing clinically important inflammatory change in rectal biopsy 

 

 

31 

specimens. J. Clin. Pathol. 

41

, 72–79. 10.1136/jcp.41.1.72. 

7.  Funkhouser-Jones, L.J., Xu, R., Wilke, G., Fu, Y., Shriefer, L.A., Makimaa, H., 

Rodgers, R., Kennedy, E.A., VanDussen, K.L., Stappenbeck, T.S., et al. (2023). 

Microbiota produced indole metabolites disrupt host cell mitochondrial energy 

production and inhibit Cryptosporidium parvum growth. BioRxiv Prepr. Serv. Biol., 

2023.05.25.542157. 10.1101/2023.05.25.542157. 

8.  Yui, S., Azzolin, L., Maimets, M., Pedersen, M.T., Fordham, R.P., Hansen, S.L., 

Larsen, H.L., Guiu, J., Alves, M.R.P., Rundsten, C.F., et al. (2018). YAP/TAZ-

Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue 

Regeneration. Cell Stem Cell 

22

, 35-49.e7. 10.1016/j.stem.2017.11.001. 

9.  Wang, Y., Song, W., Wang, J., Wang, T., Xiong, X., Qi, Z., Fu, W., Yang, X., and 

Chen, Y.-G. (2019). Single-cell transcriptome analysis reveals differential nutrient 

absorption functions in human intestine. J. Exp. Med. 

217

, e20191130. 

10.1084/jem.20191130. 

10. Ishikawa, K., Sugimoto, S., Oda, M., Fujii, M., Takahashi, S., Ohta, Y., Takano, A., 

Ishimaru, K., Matano, M., Yoshida, K., et al. (2022). Identification of Quiescent 

LGR5+ Stem Cells in the Human Colon. Gastroenterology 

163

, 1391-1406.e24. 

10.1053/j.gastro.2022.07.081. 

11. Rothenberg, M.E., Nusse, Y., Kalisky, T., Lee, J.J., Dalerba, P., Scheeren, F., Lobo, 

N., Kulkarni, S., Sim, S., Qian, D., et al. (2012). Identification of a cKit+ Colonic Crypt 

Base Secretory Cell That Supports Lgr5+ Stem Cells in Mice. Gastroenterology 

142

, 

 

 

32 

1195-1205.e6. 10.1053/j.gastro.2012.02.006. 

12. Sasaki, N., Sachs, N., Wiebrands, K., Ellenbroek, S.I.J., Fumagalli, A., Lyubimova, 

A., Begthel, H., van den Born, M., van Es, J.H., Karthaus, W.R., et al. (2016). Reg4+ 

deep crypt secretory cells function as epithelial niche for Lgr5+ stem cells in colon. 

Proc. Natl. Acad. Sci. 

113

, E5399–E5407. 10.1073/pnas.1607327113. 

13. Schumacher, M.A., Liu, C.Y., Katada, K., Thai, M.H., Hsieh, J.J., Hansten, B.J., 

Waddell, A., Rosen, M.J., and Frey, M.R. (2023). Deep Crypt Secretory Cell 

Differentiation in the Colonic Epithelium Is Regulated by Sprouty2 and Interleukin 13. 

Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 

15

, 971–984. 10.1016/j.jcmgh.2022.11.004. 

14. Nyström, E.E.L., Martinez-Abad, B., Arike, L., Birchenough, G.M.H., Nonnecke, E.B., 

Castillo, P.A., Svensson, F., Bevins, C.L., Hansson, G.C., and Johansson, M.E.V. 

(2021). An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus 

barrier function. Science 

372

, eabb1590. 10.1126/science.abb1590. 

15. Bergstrom, K.S.B., and Xia, L. (2013). Mucin-type O-glycans and their roles in 

intestinal homeostasis. Glycobiology 

23

, 1026–1037. 10.1093/glycob/cwt045. 

16. Kiela, P.R., and Ghishan, F.K. (2016). Physiology of Intestinal Absorption and 

Secretion. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 

30

, 145–159. 

10.1016/j.bpg.2016.02.007. 

17. Ito, G., Okamoto, R., Murano, T., Shimizu, H., Fujii, S., Nakata, T., Mizutani, T., Yui, 

S., Akiyama-Morio, J., Nemoto, Y., et al. (2013). Lineage-Specific Expression of 

 

 

33 

Bestrophin-2 and Bestrophin-4 in Human Intestinal Epithelial Cells. PLOS ONE 

8

, 

e79693. 10.1371/journal.pone.0079693. 

18. Parikh, K., Antanaviciute, A., Fawkner-Corbett, D., Jagielowicz, M., Aulicino, A., 

Lagerholm, C., Davis, S., Kinchen, J., Chen, H.H., Alham, N.K., et al. (2019). Colonic 

epithelial cell diversity in health and inflammatory bowel disease. Nature 

567

, 49–55. 

10.1038/s41586-019-0992-y. 

19. Kanaya, T., Hase, K., Takahashi, D., Fukuda, S., Hoshino, K., Sasaki, I., Hemmi, H., 

Knoop, K.A., Kumar, N., Sato, M., et al. (2012). The Ets transcription factor Spi-B is 

essential for the differentiation of intestinal microfold cells. Nat. Immunol. 

13

, 729–

736. 10.1038/ni.2352. 

20. Beumer, J., Puschhof, J., Bauzá-Martinez, J., Martínez-Silgado, A., Elmentaite, R., 

James, K.R., Ross, A., Hendriks, D., Artegiani, B., Busslinger, G.A., et al. (2020). 

High-Resolution mRNA and Secretome Atlas of Human Enteroendocrine Cells. Cell 

181

, 1291-1306.e19. 10.1016/j.cell.2020.04.036. 

21. Fujii, M., Matano, M., Toshimitsu, K., Takano, A., Mikami, Y., Nishikori, S., Sugimoto, 

S., and Sato, T. (2018). Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity 

and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition. Cell Stem Cell 

23

, 787-

793.e6. 10.1016/j.stem.2018.11.016. 

22. Ohara, T.E., Colonna, M., and Stappenbeck, T.S. (2022). Adaptive differentiation 

promotes intestinal villus recovery. Dev. Cell 

57

, 166-179.e6. 

10.1016/j.devcel.2021.12.012. 

 

 

34 

23. He, X.-S., Ye, W.-L., Zhang, Y.-J., Yang, X.-Q., Liu, F., Wang, J.-R., Ding, X.-L., 

Yang, Y., Zhang, R.-N., Zhao, Y.-Y., et al. (2022). Oncogenic potential of BEST4 in 

colorectal cancer via activation of PI3K/Akt signaling. Oncogene 

41

, 1166–1177. 

10.1038/s41388-021-02160-2. 

 

 

Figure 1

A

B

D

C

I

LGR5

ASCL2

OLFM4

SMOC2

MKI67

PCNA

ATOH1

SPDEF

GFI1

FOXA3

NEUROG3

AQP8

CA1

CA4

SLC26A3

MUC2

BEST2

SPINK4

FCGBP

MEP1B

KLK1

CHGA

NEUROD1

2

1

0

-1

-2

Z-Score

SC

TA

Secretory
progenitor

EC

GC

EEC

d0

d4

d14

d7

d21

d0

d2

d4

d7

0

10

20

30

LGR5

R

el

at

iv

e

ex

pr

es

si

on

✱✱✱

✱

✱

d0

d2

d4

d7

0

10

20

30

40

MKI67

✱✱✱✱

✱

✱

d0

d2

d4

d7

0

2

4

6

8

10

AQP8

✱

d0

d2

d4

d7

0

5

10

15

20

25

MUC2

✱✱✱

d0

d2

d4

d7

0

10

20

30

40

50

CHGA

✱✱

14

7

4

0

Day

F

E

N

VIL1

SLC26A3

MUC2

CHGA

DSS Regenerative

IEC Signature

IEC Signature

Upregulated in Health

IEC Signature

Upregulated in UC

H

d0

d1

d2

d4

d7

0

100

200

300

EdU

Positive

C

ells/Field

✱✱✱

✱

✱✱

G

NES = 2.07
FDR < 0.001

ES

NES = 2.19
FDR < 0.001

NES = -2.91
FDR < 0.001

ALI Day 0

ALI Day 7

ALI Day 0

ALI Day 7

ALI Day 0

ALI Day 7

0.0

0.4

0.3

0.2

0.1

ES

-0.1

0.5

0.0

-0.1

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

ES

0.0

0.4

0.3

0.2

0.1

-0.1

Day

0

Day

7

0

20

40

60

Cell height (

μ

m)

✱

Figure 2

D

A

F

G

−

5

0

5

10

−

5

0

5

10

UMAP_1

UMAP_2

9

8

4

3

2

7

6

5

1

10

11

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

SC
TA
Early EC
EC
GC
GC-sub1

nc-GC
CA7
EEC
TC

GC-sub2 (DCS-like)

B

GNG13

LRMP

POU2F3

TAS1R3

PTGS1

TRPM5

PAX6

ARX

INSM1

SST

PYY

GCG

NEUROD1

CHGA

FKBP1A

NOTCH2

CPA6

SPIB

LYZ

CA7

MUC12

NEAT1

DST

PLCG2

AGR2

REG4

SOX4

HES6

CALN1

SPINK4

FCGBP

TFF3

MUC2

SPINK5

FABP1

SLC26A3

SLC26A2

TOP2A

MKI67

OLFM4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

SC
TA
Early EC
EC
GC
GC-sub1

nc-GC
CA7
EEC
TC

GC-sub2 (DCS-like)

1

2

10

9

8

7

6

5

4

3

11

Expression

-2

-1

0

1

2

Phase

G1

G2M
S

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Propor

tion of Cell Cycle  Phases

SC TA

Ea

rly EC

EC GC

GC-sub1 (DCS-like)

GC-sub2

EEC TC

CA7

nc-GC

I

H

E

J

K

L

L-cell

D-cell

EC

Progenitor

−

6

−

3

0

3

6

−

5.0

−

2.5

0.0

2.5

5.0

Progenitor

EC

L

−

cell

D

−

cell

UD

Stressed_Dying

GLP-1

5HT

STT

NEUROG3

Crypt

ALI

Human

Colon

Tissue

0

1

2

3

4

5

Pancreatic secretion

Salivary secretion

Other types of O-glycan biosynthesis

Renin secretion

cGMP-PKG signaling pathway

Mucin type O-glycan biosynthesis

-log

10

(p-value)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Riboflavin metabolism

Type II diabetes mellitus

Starch and sucrose metabolism

FoxO signaling pathway

Proximal tubule bicarbonate reclamation

Mineral absorption

-log

10

(p-value)

TC

EEC

CA7

nc

−

GC

GC-sub1

GC-sub2 (DCS-like)

GC

EC

Early EC

TA

SC

OLFM4

MKI67

TOP2A

SLC26A2

SLC26A3

FA

BP

1

SPINK5

MUC2TFF3

FCGBP

SPINK4

CALN1

HES6

SO

X4

REG4

AGR2

PLCG2

DST

NEA

T1

MUC12

BEST4

OTO

P2CA7

HES4

LYZSPIBCPA

6

NO

TCH2

FKBP1A

CHGA

NEU

ROD1GCGPYY

SST

INSM1

ARXPA

X6

TRPM5

PTGS1

TAS1R3

POU2F3

LRMP

GNG13

% Expressed

0
25
50
75
100

−

2

−

1

0

1

2

Ave. Expression

C

Top 6 Upregulated

Pathways in GCs

Top 6 Upregulated

Pathways in nc-GCs

0

1

2

3

LGR5

0

1

2

ASCL2

0

1

2

3

4

OLFM4

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

4

SMOC2

TC

EEC

CA7

nc

−

GC

GC

−

sub1

GC-sub2 (DCS-like)

GC

EC

Early EC

TA

SC

LGR5

ASCL2

OLFM4

SMOC2

LRIG1

HOPX

BMI1

% Expressed

0
25
50
75
100

−

2

−

1

0

1

2

Ave. Expression

 

 

1 

Supplementary Figure 1

 

(A) A representative H&E image of crypt abscess from disease mucosa of an ulcerative 

colitis case. 

∗

 indicates an abscess part which is surrounded by squamous-shaped IECs. 

Scale bar: 50 μm.

 

(B) H&E staining of human ileum cells at ALI day 14. A representative image of three 

rectum lines (n =3)

.  Scale bar: 50 μm.

 

(C) MUC2 staining shows that goblet cells in the human colon monolayer in ALI culture 

produce extracellular mucus layers (outlined with red dashed lines) as 

in vivo

 structure. 

The extracellular mucus layers get thicker as ALI culture progresses. 

(D) Immunofluorescence of 

Shigella flexneri

 (red) with beta Catenin (upper panel, green), 

and with MUC2 (lower panel, green), in homeostatic colon monolayer cells during ALI 

cultivation, co-cultured with 

Shigella flexneri

 applied to the apical side of the monolayer. 

Representative images of three independent experiments. 

(E) Bright field imaging of human colon organoids three days after passage from ALI day 

14 monolayer cells (upper panel, scale bar: 200 

μ

m), and H&E staining of human colon 

monolayer cells at ALI day 14 after passage from ALI day 14 monolayer cells (lower 

panel, scale bar: 50 

μ

m). Representative images of three rectum lines (n =3). 

(F) Whole mount imaging of EdU staining in human colon monolayer cells at ALI day 0, 

2, 4, and 7. Cells were stained for EdU (Green) and Nuclei (Gray). Representative 

images of three rectum lines (n =3). 

(G-H) GSEA-based analysis of genes associated with fetal-like IECs (G), and with YAP 

signaling (H), in cells at ALI day 0 compared with those at ALI day 7. NES and FDR are 

shown. 

 

 

2 

(I-J) Heatmap of selected major YAP target genes (I), and WNT target genes (J), of 

human colon monolayer cells at ALI day 0, 2, 7, 14, and 21. n = 3 technical replicates 

per time point, except for n = 2 at ALI day 21. 

 

 

 

3 

Supplementary Figure 2 

(A) UMAP clustering of scRNAseq analysis of human colonic spheroids cultured in WRN-

CM for three days, integrated out of the same three rectum lines (n = 3) as used in 

scRNAseq analysis at ALI day 7. 

(B) UMAPs of HOPX (colitis-associated regenerative SC marker defined in mice), 

LRIG1 (quiescent SC marker defined in mice), BMI1 (reserve SC marker defined in 

mice), associated with Figure 2D. 

(C) UMAPs of MKI67 and PCNA. Seeing this along with S2D, most of PCNA positive 

cells are in S phase, while most of MKI67 positive cells are in G2M phase. 

(D) Cell cycle analysis to visualize cells in G1, G2M, or S phase in UMAPs, associated 

with Figure 2G. 

(E) UMAP of mitochondrial gene ratio represents the GC-sub1 cluster with higher 

mitochondrial gene ratio than the other GC clusters. 

(F) UMAP of PLCG2, a candidate marker of nc-GC cells. 

(G-H) UMAPs of BEST4 and CA7 (G), SPIB and GP2 (H), associated with CA7 cluster. 

(I) Dot plot of ECC subcluster marker expression in each EEC subcluster, associated 

with Figure 2K. 

(J) UMAP of mitochondrial gene ratio in ECC subclusters. 

(K-L) UMAPs of REG4 and AGR2 (K), DLL1, DLL4, and EGF (L), associated with DCS-

like cluster. 

 

Supplementary Figure 1

A

*

*

B

D

d7

d14

d28

C

β

-Catenin

Shigella

Shigella

MUC2

E

ALI to 3D spheroid

ALI to ALI

F

day 7

day 4

day 2

day 0

EdU

Fetal-like IEC Signature

NES = 1.79
FDR < 0.001

ES

0.0

0.4

0.3

0.2

0.1

-0.1

YAP Signaling

NES = 2.40
FDR < 0.001

0.0

0.4

0.3

0.2

0.1

ES

-0.1

0.5

AXL

CCN1

AMOTL2

CCN2

d0

d4

d14

d7

d21

PLAU
MYC
MMP7
TCF7
CCND1
FSCN1
DKK1
SOX9
TIAM1
AXIN2
EFNB1
JUN
BMP4
PPARD
VEGFA
MET
EDN1
FOSL1
JAG1
BIRC5
CD44
CLDN1
NOS2
LGR5
ID2
MYCBP

d0

d4

d14

d7

d21

G

H

J

I

ALI Day 0

ALI Day 7

ALI Day 0

ALI Day 7

NucleiNuclei

Supplementary Figure 2

−

4

0

4

−

5.0

−

2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

0.05

0.10

0.15

EEC MitRatio

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

SPIB

H

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

GP2

I

J

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

4

REG4

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

4

5

AGR2

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

DLL1

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

4

DLL4

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

EGF

K

L

Stressed_Dying

UD

D

−

cell

L

−

cell

EC

Progenitor

CHGA

NE

UR

OG3

TPH1 GCG PYY SST

Percent Expressed

0
25
50
75
100

−

2

−

1

0

1

2

Average Expression

B

G1

G2M

S

−

5

0

5

10

−

5

0

5

10

−

5

0

5

10

−

5

0

5

10

SC
TA
Early EC
EC
GC
GC

−

sub1

GC

−

sub2

nc

−

GC

CA7
EEC
TC

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

MKI67

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

PCNA

C

D

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0.05

0.10

0.15

E

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

2

4

6

F

PLCG2

G

3

1

0

6

5

4

8

2

7

−

4

0

4

8

−

5

0

5

10

0
1
2
3
4
5
6
7
8

0

1

2

3

LRIG1

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0.00

0.25

0.50

0.75

HOPX

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

BMI1

Mit Ratio

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

−

10

−

5

0

5

10

15

−

10

−

5

0

5

10

0

1

2

3

BEST4

CA7

A

 

 

1 

Supplementary Table S1 

Antibody 

Dilution 

Rabbit monoclonal anti-Villin antibody (SP145) 

1/1000 

Rabbit polyclonal anti-SLC26A3 antibody 

1/100 

Mouse monoclonal anti-MUC2 antibody (F-2) 

1/100 

Rabbit polyclonal anti-Chromogranin A antibody 

1/2000 

Goat polyclonal anti-5-HT antibody 

1/5000 

Rabbit polyclonal anti-GLP-1 antibody 

1/200 

Rabbit polyclonal anti-Neurogenin 3 antibody 

1/200 

Rabbit polyclonal anti-SST antibody 

1/1000 

Mouse monoclonal anti-beta-Catenin antibody 

1/1000 

Rabbit polyclonal anti-Shigella antibody 

1/1000